Eine einzelne Myh11-Lysin-Deletion verursacht eine Aortendissektion, indem sie die strukturelle Integrität und Kontraktilität der Aorta verringert

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8844 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Pathogene Varianten in der schweren Kette von Myosin (Myh11) verursachen familiäre Aneurysmen und Dissektionen der Brustaorta (FTAAD). Die zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen bleiben jedoch aufgrund fehlender Tiermodelle unklar. In dieser Studie haben wir ein Mausmodell mit Myh11 K1256del erstellt, der pathogenen Variante, die wir zuvor in zwei FTAAD-Familien gefunden haben. Die Myh11∆K/∆K-Aorta zeigte eine erhöhte Wanddicke und ultrastrukturelle Anomalien, einschließlich einer geschwächten Zelladhäsion. Bemerkenswerterweise entwickelten die Myh11∆K/+-Mäuse Aortendissektionen und intramurale Hämatome, wenn sie mit Angiotensin II stimuliert wurden. Mechanistisch gesehen wurde die Integrin-Untereinheit alpha2 (Itga2) in den Myh11∆K/∆K-Aorten herunterreguliert, und die Zellen der glatten Muskelzelllinie, die sich von Myh11∆K/∆K differenzierten, induzierten pluripotente Stammzellen. Die Kontraktilität der Myh11∆K/∆K-Aorten als Reaktion auf Phenylephrin war ebenfalls verringert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch die Herunterregulierung von Itga2 angezeigte suboptimale Zelladhäsion einen Defekt in der Kontraktion der Aorta verursacht. Folglich kann die fehlerhafte Kontraktion den hämodynamischen Stress erhöhen, der den Aortendissektionen zugrunde liegt.

Mindestens 20 % der Patienten mit Erkrankungen der Brustaorta ohne syndromale Merkmale haben einen betroffenen Verwandten ersten Grades, bekannt als familiäre Aneurysmen und Dissektionen der Brustaorta (FTAAD)1,2,3. Vier pathogene Gene, die mit der kontraktilen Funktion der glatten Muskulatur assoziiert sind (ACTA2, MYH11, MYLK und PRKG1), wurden identifiziert4,5,6,7. Obwohl es sich bei FTAAD um eine nicht-syndromale Erkrankung der Brustaorta handelt, weisen Patienten mit pathogenen Varianten in diesen Genen ähnliche Aortenphänotypen auf wie syndromale Erkrankungen der Brustaorta8. MYH11 kodiert für die glatte Muskel-spezifische Myosin-Schwerkette (SM-MHC), und die pathogenen Varianten in MYH11 wurden in 2 % der Familien mit FTAAD/offenem Ductus arteriosus (PDA)9 berichtet. Pathogene Varianten kommen hauptsächlich in der C-terminalen Coiled-Coil-Region von SM-MHC vor und beeinflussen voraussichtlich die Polymerisation dicker Filamente4. Eine genetische Veränderung in Myh11, selbst die seltene Variante oder Kopienzahlvariante, die in großen Populationen identifiziert wurde, stört die Zytoskelett- und Kontraktilfunktion glatter Muskelzellen (SMCs) und erhöht den intrazellulären Stress in vitro, was zu einer Remodellierung bei Erkrankungen der Brustaorta führt10,11,12 . Allerdings bleibt die Pathogenese, wie die pathogene Myh11-Variante zur Aortendissektion führt, mangels geeigneter Tiermodelle unklar.

Kürzlich haben wir über eine Deletionsvariante (K1256del) in MYH11 berichtet, die die Vier-Lysin-Anordnung von K1253–K1256 im Bereich des leichten Meromyosins stört. Sie war in zwei voneinander unabhängigen japanischen FTAAD-Stammbäumen artenübergreifend vollständig konserviert andere13. In dieser Studie haben wir ein Mausmodell dieser pathogenen Variante Myh11 K1256del unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems entwickelt, um die Pathogenese von FTAAD zu bewerten, das von der pathogenen Variante Myh11 stammt.

Um die pathologischen Auswirkungen der Deletionsvariante von Myh11 1256 K zu untersuchen, haben wir versucht, diese Variante mithilfe des CRISPR-Cas9-Systems in B6-Mäuse einzuführen, aber diese Genmanipulation führte zu embryonaler Letalität. Die Ursache der embryonalen Letalität wurde nicht weiter untersucht. Um die Off-Target-Effekte des CRISPR-Cas9-Systems zu reduzieren, verwendeten wir Cas9 (D10A)-mRNA, um vier Gründermäuse zu erzeugen (Abb. 1B): drei Heterozygoten (ein Mann und zwei Frauen) und einen männlichen Homozygoten (Abb. 1C). D). Die heterozygoten Zuchtpaare wurden zur Erzeugung von Homozygoten verwendet, es gelang ihnen jedoch nicht, ihre Nachkommen zu fördern. Die Ursache der Vernachlässigung wurde nicht untersucht und ist weiterhin unbekannt. Der homozygote Gründer starb plötzlich im Alter von vier Wochen (aus ungewisser Ursache, aber nicht aufgrund einer Aortenerkrankung). Als nächstes sammelten wir Sperma von der toten Homozygote, das für die In-vitro-Fertilisation und den Embryotransfer mit B6-Weibchen verwendet wurde. Als Ergebnis haben wir fünf Heterozygoten der nächsten Generation erzeugt und diese mehr als dreimal rückgekreuzt. Anschließend wurden Wildtyp- (WT), heterozygote (Myh11∆K/+) und homozygote (Myh11∆K/∆K) Mäuse, die durch Linienkreuzung gewonnen wurden, für die Analyse verwendet. Die Genotypen aller Mäuse wurden durch eine DNA-Sequenzanalyse der genetisch veränderten Stelle bestimmt (Abb. 1E).

CRISPR/Cas9-basierte Generation von Myh11 (Δ1256K)-Mäusen. (A) Sequenz von Exon 28 von murinem Myh11, an das sowohl gRNA1 als auch 2 binden, und eine Myh11 (Δ1256K)-DNA-Donor-Targeting-Site. Die PAM- und modifizierte PAM-Sequenzstelle im Myh11 (Δ1256K)-DNA-Donorfragment werden durch Rot bzw. Grün angezeigt. Die Positionen der PCR-Primer sind durch Pfeile gekennzeichnet. (B) Tabelle mit einer Zusammenfassung der Anzahl (Anzahl) der injizierten Zygoten, Nr. Zygoten übertragen und nein. Dargestellt sind die zur vollen Reife entwickelten Zygoten. Das Nein. Es wird auch die Zahl der Welpen angezeigt, die Knock-in zeigen. (C) Sequenzen rund um die Myh11-Zielstelle in Wildtyp- (WT) und Knock-in-Proben (Nr. 16, 20, 22 und 24). Das obere Feld zeigt Sequenzen mit der Deletion von AAG allein und solche, in denen beide PAM-Sequenzen (rot) in modifizierten PAM-Sequenzen (grün) in den Proben mit den Nummern 16, 20 und 24 geändert wurden. Das untere Feld zeigt die Sequenzen, die die Deletion von AAG allein zeigen und solche, bei denen nur eine von gRNA1 erkannte PAM-Sequenz (rot) in modifizierte PAM-Sequenzen (grün) geändert wurde, die von gRNA1 in der Probe mit der Nummer 22 erkannt werden. (D) Aminosäuresequenzen um die Myh11-Zielstelle von WT- und Knock-in-Proben (Nr. 16, 20, 22 und 24). Beachten Sie, dass die Sequenzen aller Knock-in-Welpen mit denen der WT-Welpen identisch sind, mit Ausnahme des Fehlens von Lysin (K) in den Knock-in-Welpen. Rot zeigt Aminosäuren, die WT-PAM-Sequenzen entsprechen. Grün zeigt Aminosäuren, die modifizierten PAM-Sequenzen entsprechen. Das Nein. Die Linie 22 mit von gRNA2 erkannten WT-PAM-Sequenzen wurde für die weitere Analyse ausgewählt, da ihre Allele nahe am WT-Myh11-Allel liegen. Das Nein. Die Linie 22 wurde über zwei Generationen hinweg auf den B6-Hintergrund zurückgekreuzt. (E) Myh11 (Δ1256K) Genotypisierung der Nr. 22-Linie durch direkte Sequenzierung von PCR-Produkten, die der Myh11-Zielstelle entsprechen. Die blaue Linie zeigt AAG × 4, die rote Linie zeigt AAG × 3 und der Pfeil zeigt den Beginn der Fehlerideogramme.

Myh11∆K/+-Weibchen wurden normal trächtig und ihre mutierten Jungen zeigten Mendelsche Verhältnisse; Allerdings kam es gelegentlich zu perinatalen Problemen wie Kindsmord und Verlassenheit. Bei Myh11∆K/∆K-Müttern kam es häufiger zu Totgeburten als bei WT (ergänzende Abbildung 1A), und selbst homozygote Mütter starben häufig während der Entbindung, weil die Entbindungszeit um mehr als 24 Stunden verlängert wurde (ergänzende Abbildung 1B). . Da wir durch natürliche Paarung eine relativ kleine Anzahl von Myh11∆K/∆K-Männchen erzeugten, verwendeten wir In-vitro-Fertilisation und Embryotransfer, um Homozygoten für unsere Experimente zu erzeugen, und die Leihmütter für den Embryotransfer trugen und zogen ihre Welpen normal auf. Nach dem Absetzen wuchsen die Myh11∆K/∆K-Welpen normal und lebten mehr als 18 Monate ohne Aortendissektion (ergänzende Abbildung 1C).

Um die strukturellen Merkmale der Myh11∆K/∆K-Aorten zu bewerten, haben wir die Aorten (aufsteigend, absteigend und abdominal) aus WT-, Myh11∆K/+- und Myh11∆K/∆K-Mäusen im Alter von 12 Wochen herausgeschnitten (n = 5). ) zur histologischen Beobachtung. Die Myh11∆K/∆K-Aorten zeigten eine erhöhte mediale Dicke (WT vs. Myh11∆K/∆K, p < 0,05) und eine verdickte Adventitia (p < 0,05), aber kein signifikant erweitertes Aortenlumen (p = 0,30). Umgekehrt zeigten die Myh11∆K/+-Aorten im Vergleich zu den WT-Aorten keinen statistisch signifikanten Anstieg der Dicke der Media oder Adventitia (Abb. 2A, B und ergänzende Abb. 2). Keine der Aortenregionen zeigte im Vergleich zu den anderen Regionen eine höhere Dissektionsrate (Ergänzungstabelle 1).

Die aufsteigenden Aorten von Myh11∆K/∆K zeigten Phänotypen einer medialen Degeneration. (A) Repräsentative Architektur der Aortenwand (aufsteigende, absteigende und Bauchaorta) von 12 Wochen alten WT- und Myh11∆K/∆K-Mäusen. Die Querschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (HE), Elastica van Gieson (EVG, für Elastin) und Masson-Trichom (MT, für Kollagen; Maßstabsbalken = 50 µm, × 400) gefärbt. Myh11∆K/∆K-Aorten zeigten teilweise Risse der elastischen Fasern und eine erhöhte Dicke der Media und Adventitia. (B) Morphometrische Parameter der aufsteigenden Brustaorten WT, Myh11∆K/+ und Myh11∆K/∆K. Die Umfangslänge unterschied sich nicht zwischen den Aorten WT, Myh11∆K/+ und Myh11∆K/∆K (links, n = 5), während die Mediadicke (Mitte, n = 5) und die Adventitiadicke (rechts, n = 5) unterschied ) der Myh11∆K/∆K-Aorten waren im Vergleich zu denen der WT-Aorten signifikant erhöht. ** p < 0,01, einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test. (C) Grobes Erscheinungsbild eines Shunt-Gefässes zwischen dem distalen Bogen und der Pulmonalarterie, das als offener Ductus arteriosus (PDA) angesehen wird, bei 12 Wochen alten Myh11∆K/∆K-Mäusen.

Bei allen präparierten Myh11∆K/∆K-Mäusen wurde ein Shunt-Blutgefäß beobachtet, das den distalen Aortenbogen und die Pulmonalarterie verband (Abb. 2C) und einem PDA ähnelte, das häufig mit FTAAD assoziiert ist. Darüber hinaus wurden bei den Myh11∆K/∆K-Mäusen eine vergrößerte Blase, geschwollene Nieren, die auf Hydronephrose hinweisen, und hypoplastische Uteri beobachtet (ergänzende Abbildung 3A). In Myh11∆K/∆K-Blasen wurden häufig ungleichmäßige Färbungen wie Ausstanzungen und Lücken zwischen den glatten Muskelschichten beobachtet (ergänzende Abbildung 3B). Bei der Quantifizierung der Dicke der glatten Muskelschichten (Myometrie) stellten wir fest, dass das Myometrium des Myh11∆K/∆K-Uterus dünner war als das des WT (ergänzende Abbildungen 3C und D).

Um die Mikrostrukturen der Aorta zu analysieren, untersuchten wir die absteigenden Aorten von WT- und Myh11∆K/∆K-Mäusen im Alter von 18 Wochen mittels Elektronenmikroskopie, wobei wir davon ausgingen, dass jede Aortenregion in ähnlicher Weise für eine Dissektion prädisponiert war, da das Auftreten einer Dissektion nicht auf eine bestimmte Region ausgerichtet war (Ergänzungstabelle 1). Die Ergebnisse zeigten eine dünnere Kernhülle und zahlreiche körnige Komponenten im mutierten Kern (Abb. 3A, obere Reihe), die in der Kernmorphologie als vorherrschendes Euchromatin und weniger Heterochromatin auftraten, was auf aktive Transkriptionsaktivitäten hinweist. Diese Kernmerkmale deuteten auf eine latente Verschiebung vom kontraktilen Phänotyp zum synthetischen Phänotyp in einem Teil der mutierten SMCs hin. Myh11∆K/∆K-SMCs zeigten auch eine Abschwächung der Zelladhäsion an andere benachbarte Zellen und waren größer als WT-SMCs (Abb. 3A, mittlere und untere Reihe). Darüber hinaus haben wir einige Merkmale entdeckt, die häufig in toten Zellen in Myh11∆K/∆K-SMCs beobachtet werden. In Myh11∆K/∆K-SMCs wurden häufig vermehrt Organellen beobachtet, und gelegentlich wurden Ablagerungen entdeckt (Abb. 3B). Wir fanden auch konzentrisch geschichtetes osmiophiles Material, sogenannte Myelinfiguren, innerhalb oder außerhalb der mutierten SMCs, die in WT recht selten waren (Abb. 3C).

Groß angelegte Elektronenmikroskopie zeigte einen erhöhten intrazellulären Stress, eine verringerte Elastinlamelle und eine abgeschwächte Zelladhäsion in Myh11∆K/∆K-Aorten. (A) Elektronenmikroskopische Bilder der absteigenden Aorten WT und Myh11∆K/∆K+. Myh11∆K/∆K-Kerne enthielten eine dünnere Kernhülle und viele körnige Komponenten (obere Reihe, Maßstabsbalken = 1 µm, × 10.000). Die Klebeflächen zwischen SMCs in Myh11∆K/∆K+-Aorten waren kürzer als die in WT (mittlere Reihe, Maßstabsbalken = 1 µm, × 12.000). Die Größe der SMCs in den Myh11∆K/∆K+-Aorten war größer als die im WT (untere Reihe, Maßstabsbalken = 10 µm, × 2.000). (B) Gelegentlich wurden Trümmer in den Myh11∆K/∆K-Aorten gefunden (Maßstabsbalken = 1 µm, × 10.000). (C) Myelinfiguren waren innerhalb oder außerhalb von Myh11∆K/∆K-SMCs vorhanden [Maßstabsbalken = 1 µm, × 12.000 (links), × 20.000 (rechts)]. (D) Die Klebelänge der SMCs in der Myh11∆K/∆K-Aorta war deutlich kürzer als die im WT [n = 45 (15 Zellen pro Aortenprobe), WT 12,50 ± 8,16 µm/Zelle vs. Myh11∆K/ ∆K 7,28 ± 4,66 µm/Zelle, p < 0,01). (E) Das Flächenverhältnis der elastischen Lamellen im 50-µm-Abschnitt war in MYH11∆K/∆K-Aorten im Vergleich zu dem in WT verringert [n = 45 (15 von 50-µm-Abschnitten pro Aortenprobe), WT 0,29 ± 0,04 vs. Myh11∆K/∆K 0,23 ± 0,02, p < 0,01]. ** p < 0,01, Mann-Whitney-U-Test.

Um die strukturelle Integrität der Aorten zu bewerten, analysierten wir die Zelladhäsion und die Elastinlamelle weiter, indem wir umfassende Bilder von Aortenquerschnitten verwendeten, die aus großflächigen elektronenmikroskopischen Bildern gewonnen wurden. Wir haben die Länge der interzellulären Adhäsionen von längsgeschnittenen SMCs gemessen (ergänzende Abbildung 4A; ein detailliertes Protokoll finden Sie im ergänzenden Online-Material), und die interzellulären Adhäsionen waren in Myh11∆K/∆K-Aorten signifikant verkürzt (WT vs. Myh11∆). K/∆K, p < 0,01, Abb. 3D). Der Bereich der elastischen Lamellen, der als Bereich mit einfacher Textur identifiziert wurde (ergänzende Abbildung 4B; ein detailliertes Protokoll finden Sie im ergänzenden Material online), war auch in Myh11∆K/∆K-Aorten verringert (p < 0,01, Abb. 3E). .

Unter Berücksichtigung dieser morphologischen Merkmale in den Myh11∆K/∆K-Aorten stellten wir die Hypothese auf, dass Myh11 K1256del die SMC-Funktion negativ beeinflusst. Um die SMC-Kontraktilität in den Aorten zu bewerten, haben wir die isometrische Kraft der Aortenringe von WT-, Myh11∆K/+- und Myh11∆K/∆K-Mäusen im Alter von 12 Wochen als Reaktion auf kontraktile Agonisten und Vasodilatatoren gemessen. Die als Reaktion auf Phenylephrin entwickelte Kraft war in der Brustaorta von Myh11∆K/∆K-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant verringert (p <0,01, Abb. 4A). Die maximale Kraft, die als Reaktion auf die Behandlung mit Phenylephrin oder Kaliumchlorid entwickelt wurde, war in der Myh11∆K/∆K-Aorta im Vergleich zur WT-Aorta signifikant verringert (Abb. 4B). Diese verringerte Kontraktilität in Myh11∆K/∆K-SMCs kann zur abnehmenden Mechanoadaptation der Aortenwand beitragen. Im Gegensatz dazu waren die Vasodilatationsfunktionen als Reaktion auf Acetylcholin (für endothelabhängige Vasodilatation) oder Nitroprussid (für endothelunabhängige Vasodilatation) zwischen den Aorten WT, Myh11∆K/+ und Myh11∆K/∆K vergleichbar (Abb. 4C). .

Myh11 K1256del schwächte die kontraktile Funktion in Myh11∆K/∆K-SMCs ab. (A) Wirkung von Myh11 K1256del auf die durch Phenylephrin (Phe) induzierte dosisabhängige Kontraktion der Aorta. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SEM dar. (B) Streupunktdiagramm, das die Mittelwerte ± SD der maximalen Kraft zeigt, die die Aorten WT, Myh11∆K/+ und Myh11∆K/∆K nach Behandlung mit Phenylephrin (Phe) oder KCl erzeugten (WT und Myh11∆K/+: n = 5; Myh11∆K/∆K: n = 3). * p < 0,05, Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest. (C) Entspannungsrate der absteigenden Aorten als Reaktion auf Acetylcholin (ACh) und Natriumnitroprussid (SNP) nach der kontraktilen Reaktion auf 10–5 mol/L Phe (WT und Myh11∆K/+: n = 5; Myh11∆K /∆K: n = 3). Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der endothelabhängigen oder endothelunabhängigen Vasodilatation zwischen der WT- und der Myh11∆K/+-Aorta.

Die Abschwächung der strukturellen Intensität und die Fehlanpassung an mechanische Belastungen in den mutierten Aorten können dazu führen, dass Menschen eine thorakale Aortendissektion entwickeln. Um die pathologischen Mechanismen der Aortendissektion im Zusammenhang mit Myh11 K1256del zu untersuchen, verabreichten wir WT- (n = 16) und Myh11∆K/+ (n = 15) Männern im Alter von acht Wochen Ang II (1000 ng/kg/min). Osmotische Pumpen. Der systolische Blutdruck wurde vor der Implantation der Infusionspumpe und nach zweiwöchiger Ang II-Behandlung gemessen. Mit Ang II behandelte Mäuse zeigten einen Anstieg des systolischen Blutdrucks, es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen WT- und Myh11∆K/+-Mäusen (vor Implantationen: p = 0,97, nach Behandlungen: p = 0,96; ergänzende Abbildung 5A). Kleine intramurale Hämatome wurden häufig in der Brust- und Bauchaorta Myh11∆K/+ beobachtet (ergänzende Abbildung 5B). Bei sechs Myh11∆K/+-Mäusen (40,0 %) kam es zu Aortendissektionen, und zwei Mäuse (13,3 %) starben an Aneurysmarupturen. Es gab keine Verzerrung bei den Stellen der Aortendissektionen zwischen der thorakalen und der abdominalen Myh11∆K/+-Aorta (ergänzende Abbildung 5C). Im Gegensatz dazu wurden bei mit Ang II behandelten WT-Mäusen keine intramuralen Hämatome oder Aortendissektionen induziert. Wir haben auch versucht, eine ausreichende Anzahl von mit Ang II behandelten Myh11∆K/∆K-Mäusen für die Analyse zu erzeugen, es war jedoch schwierig, Aortenproben zu erhalten, da die meisten Mäuse an Aneurysmarupturen starben. In einem vorläufigen Experiment starben drei von vier mit Ang II behandelten Myh11∆K/∆K-Mäusen plötzlich zwei bis vier Tage nach Beginn der Infusion. Wir sezierten diese Mäuse und fanden einen Bruch in der aufsteigenden Aorta oder im Aortenbogen (Daten nicht gezeigt). Histologisch zeigten mit Ang II behandelte Myh11∆K/+-Aorten eine Fragmentierung der elastischen Lamellen und eine Ablagerung von fibrotischem Gewebe sowie eine luminale Ausdehnung (Abb. 5A, B). Bei der Expression des Ang II-Typ-1-Rezeptors (AGTR1) in der WT- und der Myh11∆K/∆K-Aorta wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (ergänzende Abbildung 5E).

Die Infusion von Angiotensin II (Ang II) induziert eine Aortendissektion bei MYH11∆K/+-Mäusen. (A) Pathohistologische Bilder absteigender Aorten von mit Ang II behandelten WT- und Myh11∆K/+-Mäusen. Die Querschnitte wurden mit HE, EVG und MT gefärbt (oberes Feld). Der linke Teil des Panels zeigt elastische Fragmentierung und fibrotische Gewebeablagerung in nicht präparierten Regionen (Maßstabsbalken = 50 µm, × 400). (B) Umfang der aufsteigenden Brustaorten WT und Myh11∆K/+ nach zweiwöchiger Ang-II-Infusion. WT: n = 14; Myh11∆K/+: n = 9. * p < 0,05, Mann-Whitney-U-Test.

Wir untersuchten die Gen- und Proteinexpression von Aorten von WT- und Myh11∆K/∆K-Männchen im Alter von 12 Wochen. Da die morphologischen Merkmale in mutierten SMCs auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen auf eine Transformation von einem kontraktilen Phänotyp zu einem synthetischen Phänotyp in SMCs hindeuten, haben wir die Expression von SM-Isoformen (SM1 und SM2) in den Aorten analysiert, die auf eine SMC-Differenzierung hinweisen14,15,16. Wir fanden jedoch heraus, dass die glatte Muskulatur der Aorta insgesamt keiner phänotypischen Modulation unterliegt, wie dies bei akuten Gefäßverletzungen der Fall ist, da die SM1- und SM2-Expression in der mutierten Aorta im Vergleich zu WT-Mäusen im Alter von 12 Wochen keine Abnormalität aufwies (Abb. 6A, B). und ergänzende Abb. 11). Um weiter zu untersuchen, ob die Expression oder Phosphorylierung von Proteinen, die an der Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt sind, in Myh11∆K/∆K-SMCs verändert ist, haben wir die Expression dieser Gene durch RT-qPCR und die Proteinspiegel durch Immunblotting gemessen. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen der WT- und der Myh11∆K/∆K-Aorta in der Expression von α-Glattmuskel-Aktin (Acta2), SM-MHC (Myh11) und Calponin (Cnn1) oder im Spiegel des Myosin-Regulationslichts festgestellt Kettenphosphorylierung (RLC) (Abb. 6C – F und ergänzende Abb. 6A, 12). Der Phosphorylierungsgrad der fokalen Adhäsionskinase (FAK), einem Schlüsselmolekül in den Signalkaskaden der fokalen Adhäsion, war auch zwischen der WT- und der Myh11∆K/∆K-Aorta vergleichbar (Abb. 6G und ergänzende Abb. 6A, 13, 14). . Die Expression eines Proliferationsmarkers, des proliferierenden Zellkernantigens und von Cyclin D1 war auch zwischen der WT- und der Myh11∆K/∆K-Aorta vergleichbar (ergänzende Abbildung 6B). Wir untersuchten auch die Genexpression von TGF-ß (Tgfb1) und die Transkriptionsfaktoren seiner nachgeschalteten Kaskade [Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf), MMP2 (Mmp2) und MMP9 (Mmp9)], die mit der Pathogenese bei TAD assoziiert sind. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in ihrer Expression zwischen der WT- und der Myh11∆K/∆K-Aorta beobachtet (Abb. 6C).

Expression und Phosphorylierung von Proteinen in Myh11∆K/∆K+-Aorten. (A) Die Immunfärbung für SM1 und SM2 zeigte keine offensichtlichen Unterschiede in den Ausdrücken und Verteilungen zwischen den aufsteigenden Aorten WT und Myh11∆K/∆K (Maßstabsbalken = 50 µm, × 400). (B) Densitometrische Analyse der Expression von SM1 und SM2 in WT- und Myh11∆K/∆K-Aorten. Die Proteinexpressionsniveaus wurden auf die von GAPDH normalisiert (n = 5). Der Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass der Unterschied statistisch nicht signifikant war. (C) RT-qPCR-Analyse von Acta2-, Cnn1-, Myh11-, Tgfb1-, Ctgf-, Mmp2- und Mmp9-mRNA, isoliert aus Brustaorten von WT- und Myh11∆K/∆K+-Mäusen im Alter von 12 Wochen. Die Genexpressionsniveaus wurden auf Gapdh normalisiert. Die Genexpression unterschied sich nicht signifikant zwischen der WT- und der Myh11∆K/∆K-Aorta (WT vs. Myh11∆K/∆K+ n = 5, Acta2; p = 0,11, Cnn1; p = 0,73, Myh11; p = 0,06, Tgfb1; p = 0,41, Ctgf; p = 0,29, Mmp2; p = 0,53 und Mmp9; p = 0,41). (D) Densitometrische Analyse der Expression von αSMA in WT- und Myh11∆K/∆K-Aorten. Die Proteinexpressionsniveaus wurden auf die von GAPDH normalisiert (n = 5). Der Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass der Unterschied statistisch nicht signifikant war. (E) Densitometrische Analyse der Expression von Calponin in WT- und Myh11∆K/∆K-Aorten. Die Proteinexpressionsniveaus wurden auf die von GAPDH normalisiert (n = 5). Der Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass der Unterschied statistisch nicht signifikant war. (F) Densitometrische Analyse des Verhältnisses der phosphorylierten Myosin-regulatorischen leichten Kette (RLC) zur gesamten RLC-Expression in WT- und Myh11∆K/∆K-Aorten (n = 5). Der Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass der Unterschied statistisch nicht signifikant war (p = 0,222). (G) Densitometrische Analyse des Verhältnisses der Expression der phosphorylierten fokalen Adhäsionskinase (FAK) zur gesamten FAK-Expression (n = 5). Der Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass der Unterschied statistisch nicht signifikant war (p = 0,417).

Wir haben versucht, den Mechanismus zu identifizieren, durch den die Deletion von Myh11 K1256 in vitro zu einer Aortendissektion führt, indem wir Myh11ΔK/ΔK-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) in SMCs differenzierten. Wir haben zunächst iPSCs aus embryonalen Fibroblasten der Maus mit stabiler Expression von Yamanaka-Faktoren (Oct3/4, Sox2, Klf4 und c-Myc) etabliert und die Myh11ΔK/ΔK-iPSCs auf ihre Vergleichbarkeit mit WT-iPSCs bewertet (ergänzende Abbildung 7A)17. Die Anzahl der alkalischen Phosphatase-positiven Kolonien unterschied sich nicht signifikant (ergänzende Abbildung 7B, C). Anschließend bewerteten wir die Pluripotenz durch die Erzeugung von Embryoidkörpern (EBs) mit der Methode des hängenden Tropfens und bestimmten die Dreiliniendifferenzierung jedes Genotyps. Wie im Zusatzfilm gezeigt, produzierten die WT-EBs schlagende Zellen. Allerdings waren die meisten Zellen, die aus den Myh11ΔK/ΔK-EBs wuchsen, nicht schlagend und nicht anhaftend, was darauf hindeutet, dass die pathogene Variante Myh11 K1256del die Aufrechterhaltung der Pluripotenz beeinträchtigt. Jeder Genotyp hatte neun Tage lang nach der retroviralen Transduktion eine ähnliche Morphologie, aber die Myh11ΔK/ΔK-Kolonien behielten ihre Morphologie nicht bei und ab Passage 3 begannen körnige Zellen aufzutreten (ergänzende Abbildung 8A). Anschließend haben wir Nanog zusätzlich zu den Yamanaka-Faktoren in die MEFs umgewandelt. Überraschenderweise ermöglichte die erzwungene Expression von Nanog zusammen mit den Yamanaka-Faktoren während der Neuprogrammierung somatischer Zellen, dass die Myh11ΔK/ΔK-iPSCs die ESC-ähnliche Morphologie beibehielten (ergänzende Abbildung 8B).

Nanog bindet an eine Enhancer-Region des menschlichen α-Catenin-Gens (Ctnna2) (GeneCards-Website: http://www.genecards.org)18. Die Beobachtung, dass die iPSC-Stammfunktion durch erzwungene Nanog-Expression verbessert wurde, veranlasste uns, die herunterregulierten Gene in den Myh11ΔK/ΔK-Aorten zu untersuchen, die wir mithilfe der Gene Ontology (GO)-Datenbank durch RNA-Sequenzanalyse auf Beteiligung an der Zelladhäsion identifiziert hatten19,20. Eine Untersuchung dieser Gene auf Interaktionen untereinander in der STRING-Datenbank21 ergab dann, dass Ctnna2 die höchste Anzahl an Interaktionen mit den Molekülen aufwies, die mit der interzellulären Adhäsion zusammenhängen (ergänzende Abbildung 9). Wir untersuchten den funktionellen Unterschied zwischen WT- und Myh11ΔK/ΔK-SMCs weiter, indem wir die Differenzierung von iPSCs in die SMC-Linie induzierten, indem wir die Zellen in Medien kultivierten, die Retinsäure ohne den Leukämie-Hemmfaktor enthielten. Am 5. Tag der Differenzierung hatten die Zellen keine SMC-ähnliche Morphologie angenommen (Abb. 7A). Myh11 war unabhängig vom Genotyp am dritten Tag der Differenzierung hochreguliert (Abb. 7B), was darauf hinweist, dass sich die Zellen an die SMC-Linie gebunden hatten. Die Integrin-Untereinheit α2 (Itga2) wurde in den aneurysmatischen Aorten von SMC-spezifischen Smad4-Knockout-Mäusen22 herunterreguliert, und eine STRING-Protein-Protein-Interaktionsanalyse zeigte, dass Itga2 die zweithöchste Anzahl an Wechselwirkungen mit den fokaladhäsionsbezogenen Molekülen aufwies, die herunterreguliert wurden die Myh11ΔK/ΔK-Aorta (ergänzende Abbildung 9). Messungen der mRNA-Expression von Itga2 in den Zellen der SMC-Linie zeigten auch eine signifikante Verringerung der Itga2-Expression in den Myh11ΔK/ΔK-Zellen (Abb. 7C).

Itga2 ist in den SMC-Linienzellen, die sich von Myh11∆K/∆K-iPSCs unterscheiden, herunterreguliert. (A) Phasenkontrastbilder von WT- und Myh11∆K/∆K-iPSCs am Tag 5 der Differenzierung durch Retinsäure (Maßstabsbalken = 200 µm). (B) RT-qPCR-Analyse von Myh11-mRNA-isolierten iPSCs an den Tagen 0 und 3 der Behandlung mit Retinsäure. Die Genexpressionsniveaus wurden auf 18s-rRNA normalisiert (n = 4, Tag 0: p = 0,9714; Tag 3: p > 0,9999). Mann-Whitney-U-Test. RA = Retinsäure. (C) RT-qPCR-Analyse von Itga2-mRNA-isolierten iPSCs am Tag 3 der Differenzierung durch Retinsäure. Die Genexpressionsniveaus wurden auf 18s-rRNA normalisiert. *p < 0,05, Mann-Whitney-U-Test.

Wir haben ein neuartiges Mausmodell von FTAAD mit hoher Reproduzierbarkeit der Aortendissektion und des intramuralen Hämatoms durch Ang II-Behandlung erstellt. Wir fanden heraus, dass Myh11 K1256del zu struktureller Fragilität und Fehlanpassung an mechanische Belastungen in der Aorta führt, indem es die Zusammensetzung der Elastinlamellen und die SMC-Kontraktilität verringert. Diese veränderte Eigenschaft der Myh11 K1256del-Aorten erhöht die Assoziation mit dem Beginn einer Aortendissektion.

Wir gehen davon aus, dass die Myosinfilamentanordnung in Gegenwart von K1256del unterbrochen werden könnte, basierend auf der Modellierung der Molekülstruktur23. Myosin wird typischerweise in zwei Fragmente unterteilt: N-terminales schweres Meromyosin (HMM) und C-terminales leichtes Meromyosin (LMM)24. HMM besteht aus der globulären Motordomäne (S1) und der Coiled-Coil-Region, die S1 und LMM verbindet (S2). LMM bildet durch Verflechtung mit den LMMs anderer Myosinmoleküle ein dickes Filament. K1256 befindet sich auf der N-terminalen Seite von LMM und die Aminosäuresequenz um K1256 nimmt ein typisches Muster einer Heptad-Wiederholung an, die aus hydrophoben Resten an der ersten (a) und vierten (d) Position besteht (ergänzende Abbildung 10A). . Diese hydrophoben Reste sind erforderlich, um eine Coiled-Coil-Struktur zu bilden, indem sie hydrophobe Kontakte zwischen zwei schweren Ketten herstellen25. Ergänzende Abbildung 10B zeigt ein Strukturmodell der K1256-haltigen Region (1226–1288 Reste) von Myh11. Die hydrophoben Reste von WT, mit Ausnahme von V1242, befinden sich an der Grenzfläche zwischen zwei schweren Ketten und kontaktieren einander, was darauf hindeutet, dass diese Region eine Coiled-Coil-Struktur bilden kann. Im Gegensatz dazu werden die hydrophoben Reste auf der C-terminalen Seite von K1256 durch die K1256-Deletion nach außen freigelegt, da die Reste auf der α-Helix-Struktur um 100° rotieren. Diese Änderung der Seitenkettenorientierung stört wahrscheinlich die durch die hydrophoben Kontakte stabil zusammengesetzte Coiled-Coil-Struktur, was teilweise Auswirkungen auf HMM-Funktionen haben kann, wie z. B. die Bildung dicker Filamente.

Die großflächige elektronenmikroskopische Bildgebung ist nützlich für die umfassende Beobachtung von Gewebeschnitten; Dies ist das erste Beispiel für die Anwendung dieser Methode zur Analyse eines Lumenorgans. Wir stellten eine signifikante Verringerung der Fläche der elastischen Lamellen fest, was auf eine Ausdünnung der elastischen Lamellen schließen lässt. Wie eine frühere Studie zu FTAAD gezeigt hat, scheint die Ausdünnung der elastischen Lamellen eine häufige strukturelle Veränderung der Aorten bei der pathogenen Variante zu sein, die FTAAD6 verursacht. Darüber hinaus beobachteten wir mittels konventioneller Transmissionselektronenmikroskopie pathologische Merkmale, die mit zellulären Stressreaktionen verbunden sind, wie z. B. Trümmer und Myelinfiguren. Die Expression und Verteilung von SM-Isoformen (SM1 und SM2), die molekulare Marker der SMC-Differenzierung sind14,15,16, zeigte keine offensichtlichen Veränderungen in der Myh11∆K/∆K-Mutante. Dies legt nahe, dass die glatte Muskulatur in Myh11 K1256del keiner umfassenden phänotypischen Modulation unterliegt.

In dieser Studie kam es bei Myh11∆K/+-Mäusen innerhalb von zwei Wochen nach der Ang-II-Infusion zu einer Aortendissektion und einem intramuralen Hämatom. In unserem Modell beobachteten wir eine verringerte Kontraktionskraft des Aortenrings nach Stimulation mit Phenylephrin oder KCl. Diese Beobachtung stimmt mit einem früheren Bericht über eine abgeschwächte SMC-Kontraktilität überein, die durch die Deletionsvariante im Stäbchenteil und in der motorischen Domäne von Myosin11 induziert wird. Auch großflächige Elektronenmikroskopie zeigte eine Verringerung der strukturellen Integrität der Aortenwand. Darüber hinaus unterschied sich die Expression des Ang-II-Typ-1-Rezeptors in der Myh11∆K/∆K-Aorta nicht signifikant von der im WT, was darauf hindeutet, dass die WT- und Myh11∆K/∆K-Mäuse ein vergleichbares Maß an Empfindlichkeit gegenüber exogenem Ang aufwiesen II. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Anwendung von Calciumchlorid auf die Aorta zusammen mit der Ang II-Infusion bei Mäusen zu einer Aortendissektion führen kann26. In dem Modell wurde vorgeschlagen, dass eine erhöhte hämodynamische Belastung aufgrund der Versteifung der Aorta zu einer Dissektion in Aorten mit verringerter Wandstärke führt26. Somit könnte der verstärkte hämodynamische Stress, der durch die abgeschwächte Kontraktion verursacht wird, letztendlich eine Aortendissektion verursacht haben.

Die Stabilisierung des submembranösen Zytoskeletts wird als wichtig für die effiziente Kraftentwicklung von SMCs angesehen, und es wurden zwei Wege der Kontraktion der glatten Muskulatur vorgeschlagen27. Ein Weg beinhaltet die Myosin-RLC-Phosphorylierung27, aber unsere RLC-Phosphorylierungsanalyse durch Immunoblot zeigte keine Abschwächung dieses Weges in Myh11ΔK/ΔK-Aorten. Der andere Weg beinhaltet die Mechanotransduktion an fokalen Adhäsionsverbindungen27. Unsere RNA-Sequenzierung der Myh11ΔK/ΔK-Aorta zeigte eine Herunterregulierung des Itga2-Gens, das für die Integrin-Untereinheit Alpha 2 (Itga2) kodiert, die an der fokalen Adhäsion28 beteiligt ist (Myh11ΔK/ΔK/WT-Verhältnis (log2) = – 1,76). Unabhängig von ihrem Genotyp regulierten die iPSCs Myh11 nach dreitägiger Kultur mit Retinsäure hoch, was darauf hindeutet, dass die K1256-Deletion die Differenzierung in SMCs nicht hemmte. Die Expression von Myh11 war zwischen den WT- und Myh11∆K/∆K-Zellen vergleichbar, aber die Expression von Itga2 war in den Myh11∆K/∆K-iPSCs geringer als in den WT-iPSCs. Die neu differenzierten Zellen zeigten eine Abnahme der Itga2-Expression, was darauf hindeutet, dass die in der Myh11ΔK/ΔK-Aorta festgestellte Herunterregulierung von Itga2, die durch die RNA-Sequenzierungsanalyse nachgewiesen wurde, direkt durch die pathogene Variante Myh11 K1256del verursacht wird und nicht eine sekundäre Reaktion auf durch die pathogene Variante verursachte Defekte ist . Dies impliziert eine mögliche Rolle von Myh11 bei der Modulation der fokalen Adhäsion durch die Regulierung der Itga2-Expression. Frühere Berichte haben darauf hingewiesen, dass Polymorphismus in Itga2 mit ischämischem Schlaganfall und koronarer Atherosklerose assoziiert ist29 und dass Itga2 im Aortenaneurysma-Modell durch die Inaktivierung von Smad422 herunterreguliert wird. Die vorliegende Studie ist die erste, die über eine Herunterregulierung von Itga2 in der Aorta in einem FTAAD-Modell berichtet.

Frühere Studien unserer Gruppe sowie mehrerer anderer Gruppen haben gezeigt, dass primäre SMCs schnell ihre ursprünglichen Phänotypen verlieren, wenn sie in vitro kultiviert werden15,30,31,32. Daher ist es unwahrscheinlich, dass In-vitro-Studien primärer SMCs In-vivo-Ereignisse darstellen. Um kultivierte SMCs zu erhalten, die Gewebe-SMCs besser ähneln, haben wir iPSCs etabliert und die Differenzierung der iPSCs in SMCs eingeleitet. Die iPSCs, die wir aus Myh11ΔK/ΔK-MEFs mit der erzwungenen Expression von Yamanaka-Faktoren erzeugten, verloren ebenfalls ihre Pluripotenz und die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und innerhalb von fünf Passagen undifferenziert zu bleiben. Interessanterweise verbesserte die erzwungene stabile Expression von Nanog zusammen mit den Yamanaka-Faktoren die Stabilität von Myh11ΔK/ΔK-iPSCs. Da Nanog bekanntermaßen an eine der Enhancer-Regionen des menschlichen α-Catenins bindet18, könnten die Fähigkeiten von iPSCs, sich selbst zu erneuern, undifferenziert zu bleiben und die Pluripotenz aufrechtzuerhalten, durch die Hochregulierung von α-Catenin und die anschließende Stabilisierung der interzellulären Adhäsion gerettet werden . Unsere RNA-Sequenzierungsdaten der Aorta zeigten auch eine Abnahme der Expression von Ctnna2 (Myh11ΔK/ΔK/WT-Verhältnis (log2) = – 10,8) sowie einiger anderer Gene, die an der interzellulären Adhäsion beteiligt sind. Die STRING-Datenbank zeigte, dass Ctnna2, das für α-Catenin kodiert, mit der höchsten Anzahl interzellulärer adhäsionsbezogener Moleküle interagierte, die in den Myh11ΔK/ΔK-Aorten herunterreguliert wurden. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass α-Catenin Cadherin und das Actomyosin-Netzwerk verbindet und dass der Verlust der α-Catenin-Funktion die interzelluläre Adhäsion stört33. Darüber hinaus ist bekannt, dass α-Catenin als Mechanosensor33 fungiert, der die Zelladhäsion verstärkt und die Aktin-Reorganisation an Zellverbindungen fördert33. Zukünftig könnte eine Studie mit Aorten von Ctnna2-Knockout- oder Überexpressionsmäusen die Beteiligung von α-Catenin an der Stabilisierung des submembranösen Zytoskeletts und seinen Beitrag zur Aortenkontraktion aufdecken. Darüber hinaus könnte die Erhöhung der Expression von α-Catenin eine wirksame Intervention zur Verbesserung der interzellulären Adhäsion und eine neuartige Strategie zur Behandlung von FTAAD sein.

Schließlich werden mechanische Signale durch drei Mechanismen weitergeleitet. Mechanische Signale von (1) der fokalen Adhäsion werden über (3) das Actomyosin-Netzwerk an (2) die interzelluläre Adhäsionsverbindung weitergeleitet34. Von der interzellulären Adhäsionsstelle werden die Signale an die Nachbarzellen weitergeleitet34. In dieser Studie fanden wir genetische und phänotypische Veränderungen, die auf Defekte in allen drei Mechanismen unseres FTAAD-Modells hinweisen. Wir haben die Möglichkeit einer abgeschwächten fokalen Adhäsion aufgezeigt. Itga2, das an der fokalen Adhäsion beteiligt ist, wird sowohl in Myh11ΔK/ΔK-Aorten als auch in Zellen, die sich in die SMC-Linie differenzieren, herunterreguliert. Dann haben wir durch großflächige Elektronenmikroskopie ultrastrukturelle Anomalien erhalten, die auf eine fehlerhafte interzelluläre Adhäsion schließen lassen. Darüber hinaus wurde die Expression von Genen wie Ctnna2, die für α-Catenin kodieren und die interzelluläre Adhäsion regulieren, verringert. Basierend auf der Strukturanalyse (ergänzende Abbildung 10) sagen wir voraus, dass die Coiled-Coil-Struktur des Myosin-II-Moleküls Myh11 K1256del nicht optimal ist. Daher kann diese Struktur die Bildung des Actomyosin-Netzwerks abschwächen. Daher vermuten wir, dass Myh11 K1256del einen Defekt in allen drei oben genannten Mechanismen verursacht und dass sie alle zur verringerten Kontraktilität der Myh11ΔK/ΔK-Aorten beitragen. Wir weisen darauf hin, wie wichtig es ist, die Integrität aller drei Mechanismen zu testen und die Kontraktilität des SMC-Netzwerks zu überwachen, anstatt sich auf die Funktionsstörung einzelner glatter Muskeln zu konzentrieren. Wenn wir eine neue Therapiestrategie zur Verbesserung der Kontraktilität von SMCs entwickeln, kann es wichtig sein, alle drei Mechanismen ins Visier zu nehmen.

Obwohl die Abschwächung der SMC-Kontraktilität nicht zu einer Lumenausdehnung in der Myh11∆K/∆K-Aorta führte, zeigte die Gebärmutter eine deutliche Erweiterung mit einer dünneren Wand. Darüber hinaus kam es bei Myh11∆K/∆K-Müttern deutlich häufiger zu Totgeburten als bei WT-Müttern, was darauf hindeutet, dass Myh11 eine Rolle bei der Uteruskontraktion spielt. Wir beobachteten auch PDA bei allen Myh11∆K/∆K-Mäusen, wohingegen nur wenige Myh11∆K/+-Mäuse PDA aufwiesen. Die unzureichende Kontraktion des Ductus arteriosus als Reaktion auf Sauerstoff kann bei Myh11∆K/∆K-Mäusen einen PDA auslösen. Im Vergleich zu zuvor berichteten Tiermodellen mit PDA, die innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt starben, überlebten die meisten Myh11∆K/∆K-Mäuse mehr als 18 Monate mit PDA, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Mäusen um ein einzigartiges Tiermodell mit langer Lebensdauer handelt Überleben mit PDA.

Zusammenfassend induziert Myh11 K1256del pathogenen Stress an der Aortenwand durch die Induktion struktureller Fragilität und einer Störung der Mechanoadaptation in der Aorta. Diese Veränderungen können durch Defekte der fokalen Adhäsion, der interzellulären Adhäsion und des Actomyosin-Netzwerks verursacht werden. Weitere Studien sind erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der abnormalen LMM-Struktur und der Herunterregulierung von Genen zu verstehen, die fokale Adhäsionen und interzelluläre Adhäsionen bilden, da dieses Wissen für die Entwicklung einer präventiven Therapie für FTAAD von entscheidender Bedeutung ist.

Eine detaillierte Beschreibung der Methodik finden Sie in den Zusatzdaten.

C57BL/6 J-Mäuse mit dem Wildtyp oder der pathogenen Variante in Myh11 wurden nach einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zeitplan gehalten (Licht an von 07:00 Uhr bis 19:00 Uhr). Vor invasiven Eingriffen wie der Implantation einer Infusionspumpe wurden die Mäuse durch eine einzige intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Medetomidinchlorid (0,3 mg/kg), Midazolam (4 mg/kg) und Butorphanoltartrat (5 mg/kg) anästhesiert. 39. Das Fehlen eines Pedalreflexes wurde als Indikator für eine tiefe Anästhesie herangezogen. Bevor den Mäusen Gewebeproben entnommen wurden, wurden sie durch eine einzige intraperitoneale Injektion einer Überdosis Natriumpentobarbital (100 mg/kg) eingeschläfert. Alle Tierhandhabungsverfahren in dieser Studie entsprachen dem Leitfaden für Labortiere der Jichi Medical University, dem von den US National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung, achte Auflage, 2011) und den ARRIVE-Richtlinien40. Das Institutional Animal Care and Concern Committee der Jichi Medical University genehmigte alle Versuchsprotokolle. Mit Ausnahme der histologischen Analyse der Gebärmutter wurden in dieser Studie männliche Mäuse verwendet.

Nickase Cas9 [auch bekannt als Cas9 (D10A)41]-mRNA wurde unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE T3-Kits (Ambion) und Sap I-linearisiertem pBS-NFCas9 (D10A)A als RNA-Synthese-Matrize erhalten. Dieses pBS-NFCas9 (D10A)A-Plasmid wurde konstruiert, indem GAT [kodiert für Asparaginsäure (D) an der 10. Aminosäure des Cas9-Proteins] durch GCT [kodiert für Alanin (A)] im pBS-NFCas9A-Plasmid15 unter Verwendung der Umkehrung ersetzt wurde PCR-Methode. Die Genauigkeit der Nukleotidsequenz am ausgetauschten Abschnitt wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Guide-RNAs (gRNAs), die auf Myh11 (NM_001161775.1) abzielen, wurden wie von Sakurai et al.42 beschrieben hergestellt und mit gRNA1 und 2 bezeichnet (Abb. 1A und Ergänzungstabelle 2). Ein 220 Basenpaare langes Myh11-Donor-DNA-Fragment, in dem AAG (kodierend für Lysin) an der 1256. Aminosäure des MYH11-Proteins deletiert war, wurde durch eine chemische Gensynthesemethode (TaKaRa Bio) konstruiert und als Δ1256K bezeichnet. In Δ1256K wurde die PAM entsprechende Sequenz in Sequenzen geändert, die denen entsprechen, die sowohl von gRNA1 als auch von 2 erkannt werden (Abb. 1A und Ergänzungstabelle 2). Dieses Δ1256K-Fragment wurde dann in das pMD20-Plasmid (TaKaRa Bio) kloniert. Bei der Mikroinjektion wurde das Δ1256K-DNA-Donorfragment durch Verdauung mit BamHI und NdeI aus dem Plasmidrückgrat entfernt.

Um die pathologischen Auswirkungen der Deletionsvariante von Myh11 1256 K zu untersuchen, haben wir versucht, diese Variante mithilfe des Standard-CRISPR-Cas9-Systems (gRNA 1 und Δ1256K-DNA-Donor (Abb. 1A)) in B6-Mäuse einzuführen, aber diese Genmanipulation führte dazu embryonale Letalität. Wir haben die Ursache der embryonalen Letalität nicht weiter untersucht, spekulierten jedoch, dass sie möglicherweise durch die Indels in Myh11 verursacht wird, was zu einem vollständigen Funktionsverlust oder Nebenwirkungen außerhalb des Ziels führt. Daher verwendeten wir das CRISPR-Nickase-Cas9-System (zwei gRNAs und Δ1256K-DNA-Donor (Abb. 1A)), um vier Gründermäuse zu erzeugen (Abb. 1B): drei Heterozygoten (ein Mann und zwei Frauen) und eine männliche Homozygote (Abb. 1C, D). Die heterozygoten Zuchtpaare wurden zur Erzeugung von Homozygoten verwendet, doch aus unbekannten Gründen konnten sie ihre Jungen nicht aufziehen. Die Ursache der Vernachlässigung wurde nicht untersucht und ist weiterhin unbekannt. Der homozygote Gründer starb plötzlich im Alter von vier Wochen (aus ungewisser Ursache, aber nicht aufgrund einer Aortenerkrankung). Als nächstes sammelten wir Sperma von der toten Homozygote, das für die In-vitro-Fertilisation und den Embryotransfer mit B6-Weibchen verwendet wurde. Als Ergebnis haben wir fünf Heterozygoten der nächsten Generation erzeugt und diese mehr als dreimal rückgekreuzt. Anschließend wurden WT-, heterozygote (Myh11∆K/+) und homozygote (Myh11∆K/∆K) Mäuse, die durch Linienkreuzung gewonnen wurden, zur Analyse verwendet. Die Genotypen aller Mäuse wurden durch eine DNA-Sequenzanalyse der genetisch veränderten Stelle bestimmt (Abb. 1E und Ergänzungstabelle 3).

Die herausgeschnittene Aorta, Blase und Gebärmutter wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Die in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden in 5 μm dicke Scheiben geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (HE), Elastica van Gieson (EVG) und Masson-Trichrom (MT) gefärbt. Die morphometrische Analyse wurde mit ImageJ/Fiji43 durchgeführt. Die Immunfärbung mit Anti-SM1- und Anti-SM2-Antikörpern wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt14.

Brustaorten wurden mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (PB, pH 7,4) fixiert, gefolgt von einer Fixierung in 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 mol/l PB. Die Proben wurden in Epoxidharz eingebettet, in 70 nm dicke ultradünne Schnitte geschnitten und mit Uranylacetat und Bleicitrat angefärbt. Mit einem Rückstreuelektronendetektor in der Rasterelektronenmikroskopie (JSM-7800F, JEOL) wurden Hunderte digitaler Bilder von unterteilten rechteckigen Bereichen aufgenommen, die ganze Querschnitte abdecken. Alle Bilder wurden zu einem einzigen Kachelbild zusammengefügt und großformatige Kachelbilder wurden mit einem JavaScript-basierten Viewer betrachtet.

Ungefähr 10 mm der Aortenringe wurden von den anästhesierten Mäusen entfernt und mit Edelstahlklammern in einem Organbad (20 ml) befestigt, das mit einem Krebs-Henseleit-Puffer gefüllt war, der bei 37 °C gehalten und mit 95 % O2/belüftet wurde. 5 % CO2 während des gesamten Experiments. Alle Ringstreifen wurden einer Vorlast von 10 mN ausgesetzt und 60 Minuten lang inkubiert. Die Kontraktionen bei der anschließenden Phenylephrinverabreichung wurden nacheinander bestimmt und mit dem Gewebegewicht korrigiert. Die Entspannungsrate wurde auch bei der anschließenden Verabreichung von Acetylcholin und Natriumnitroprussid erreicht, nachdem der Höhepunkt der kontraktilen Reaktion auf Phenylephrin erreicht worden war (10–5 mol/l).

Den Mäusen wurden im Alter von acht Wochen osmotische Minipumpen (Modell Alzet 1002; DURECT Corporation) implantiert. Die Pumpen wurden durch Infusion mit einer Rate von 1.000 ng/kg/min mit Ang II-Lösung (Peptide Institute, Inc.) gefüllt. Der systolische Blutdruck wurde vor der Implantation und nach zweiwöchiger Ang-II-Behandlung gemessen. Alle zwei Wochen überlebenden Mäuse wurden getötet und ihre Aorten herausgeschnitten.

Die Gesamt-RNA-Extraktion und RT-qPCR wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt. Es wurden Primer für die verschiedenen Gene entworfen und die Sequenzen sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und alle Daten wurden auf die Expression von Gapdh normalisiert.

Proteinlysate wurden aus der Brustaorta hergestellt. Anschließend wurden 5 µg Gesamtprotein für jede Probe auf einem 10 %igen Bis-Tris-Gel oder 3–8 %igen Tris-Acetat-Gel (Thermo Fisher Scientific) durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem iBlot2 Dry Blotting System auf Nitrozellulosemembranen elektrogeblottet ( Invitrogen) und mit Primärantikörpern immungeblottet. Die Membranen wurden über Nacht mit geeigneten Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert und mit einem Chemilumineszenz-Kit (Bio-Rad Laboratories) sichtbar gemacht.

Die Modelle wurden durch Aminosäureaustausch mit der Kristallstruktur des menschlichen Herz-β-Myosin-S2-Fragments (PDB-ID, 2FXO) als Vorlage für die Coiled-Coil-Struktur unter Verwendung der Molecular Operating Environment (MOE)-Programmsuite (Ver. 2016.08) konstruiert , Chemical Computing Group Inc., https://www.chemcomp.com).

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Ein Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die verteilten Daten zwischen zwei verschiedenen Gruppen zu vergleichen. Vergleiche mehrerer Gruppen, die einen Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalität bestanden hatten, wurden mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt. Ein p-Wert < 0,05 galt als signifikant und ein p-Wert < 0,01 galt als hochsignifikant.

Die diesem Artikel zugrunde liegenden Daten werden auf begründete Anfrage an den entsprechenden Autor weitergegeben.

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Die Studie wurde teilweise durch Research on Grants-in-Aid for Scientific Research in Priority Areas (B) (Grant-Nr. 18H02811 an RN) und Grants-in-Aid for Scientific Research in Priority Areas (C) (Grant-Nr. 18K08046 an KA) vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Keita Negishi und Kenichi Aizawa.

Abteilung für klinische Pharmakologie, Abteilung für Pharmakologie, Jichi Medical University, 3311-1 Yakushiji, Shimotsuke, Tochigi, 329-0498, Japan

Keita Negishi, Kenichi Aizawa, Shota Tomida und Yasushi Imai

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Abteilung für Medizin, Jichi Medical University, Tochigi, Japan

Keita Negishi & Kazuomi Kario

Abteilung für Herz-Kreislauf-Forschung, Shinshu University Graduate School of Medicine, Nagano, Japan

Takayuki Shindo und Takayuki Sakurai

Abteilung für Herz-Kreislauf-Wissenschaften, Herz-Kreislauf-Forschungszentrum der Universität Leicester, Glenfield Hospital, Leicester, Großbritannien

Toru Suzuki

Systemintegrationszentrum, Universitätskrankenhaus Gunma, Gunma, Japan

Yuichiro Saito

Abteilung für Angewandte Biologische Chemie, Graduiertenschule für Agrar- und Biowissenschaften, Universität Tokio, Tokio, Japan

Takuya Miyakawa und Masaru Tanokura

RIKEN-Zentrum für Biosystemdynamikforschung, Kobe, Japan

Yosky Kataoka & Mitsuyo Maeda

RIKEN-JEOL-Kooperationszentrum, Kobe, Japan

Yosky Kataoka & Mitsuyo Maeda

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Graduate School of Medicine, Universität Tokio, Tokio, Japan

Hiroyuki Morita, Norifumi Takeda und Issei Komuro

Jichi Medical University, 3311-1 Yakushiji, Shimotsuke, Tochigi, 329-0498, Japan

Ryozo Nagai

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KA und RN konzipierten und gestalteten das Projekt; KN, KA, YS, HM, NT, IK, KK, YI und RN analysierten und interpretierten die Daten; KN, KA, T.Shindo., T.Sakurai., YK, MM, ST erfasste Daten; TM und MT führten rechnerische Analysen durch; und KN, KATSuzuki und RN haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Ryozo Nagai oder Yasushi Imai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Negishi, K., Aizawa, K., Shindo, T. et al. Eine einzelne Myh11-Lysin-Deletion verursacht eine Aortendissektion, indem sie die strukturelle Integrität und Kontraktilität der Aorta verringert. Sci Rep 12, 8844 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12418-8

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Eingegangen: 15. Juli 2021

Angenommen: 10. Januar 2022

Veröffentlicht: 25. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12418-8

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Eine einzelne Myh11-Lysin-Deletion verursacht eine Aortendissektion, indem sie die strukturelle Integrität und Kontraktilität der Aorta verringert