Die CXCL5-Unterdrückung stellt die Neovaskularisation wieder her und beschleunigt die Wundheilung bei Diabetes mellitus

Kardiovaskuläre Diabetologie Band 22, Artikelnummer: 172 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus (DM) wurde ein höherer Wert des Chemokin-CXC-Motiv-Liganden 5 (CXCL5) beobachtet; seine Rolle bei der diabetischen Vaskulopathie wurde jedoch nicht geklärt. Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen und mechanistischen Erkenntnisse von CXCL5 auf die Neovaskulogenese und Wundheilung bei DM zu untersuchen.

In vitro wurden endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) und humane Aortenendothelzellen (HAECs) verwendet. Streptozotocin-induzierte diabetische Mäuse und Leprdb/JNarl-Mäuse wurden als Typ-1- und Typ-2-DM-Modelle verwendet. Darüber hinaus wurden CXCL5-Knockout-Mäuse verwendet, um diabetische Mäuse zu erzeugen. Es wurden Ischämieoperationen an den Hinterbeinen, Aortenringtests, Matrigel-Plug-Tests und Wundheilungstests durchgeführt.

Die CXCL5-Konzentrationen waren im Plasma und im EPC-Kulturmedium von Typ-2-DM-Patienten erhöht. Der neutralisierende CXCL5-Antikörper regulierte den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)/Stroma Cell-Derived Factor-1 (SDF-1) hoch und förderte die Zellfunktion in EPCs von Typ-2-DM-Patienten und mit hohem Glukosegehalt behandelten EPCs von Nicht-DM-Patienten sowie HAECs . CXCL5 regulierte direkt Interleukin (IL)-1β/IL-6/Tumornekrosefaktor-α hoch und regulierte VEGF/SDF-1 über ERK/p65-Aktivierung durch Chemokin-CXC-Motivrezeptor 2 (CXCR2) herunter. Der neutralisierende CXCL5-Antikörper stellte den Blutfluss nach einer Ischämie der Hinterbeine wieder her, erhöhte die zirkulierende EPC-Zahl und verstärkte die VEGF- und SDF-1-Expression im ischämischen Muskel. Die CXCL5-Unterdrückung förderte die Neovaskularisation und Wundheilung in verschiedenen diabetischen Tiermodellen. Die obige Beobachtung konnte auch bei durch Streptozotocin induzierten CXCL5-Knockout-Diabetikermäusen beobachtet werden.

Die CXCL5-Unterdrückung könnte die Neovaskularisation und Wundheilung durch CXCR2 bei DM verbessern. CXCL5 kann als potenzielles therapeutisches Ziel für vaskuläre Komplikationen bei DM angesehen werden.

Diabetes mellitus (DM) ist eine chronische Stoffwechselerkrankung. Patienten leiden unter unzureichender Insulinsekretion oder Insulinresistenz, was zu Hyperglykämie führt [1,2,3]. Hyperglykämie führt zu einer verminderten Proliferation von Endothelzellen und zur Rekrutierung von unteren endothelialen Vorläuferzellen (EPCs), was zu einer gestörten Angiogenese führt. Tatsächlich ist eine gestörte Angiogenese an vaskulären Komplikationen bei DM beteiligt. Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine der schwerwiegendsten Komplikationen [4, 5] und die Haupttodesursache bei Patienten mit DM [6]. Darüber hinaus weisen DM-Patienten mit pAVK eine beeinträchtigte Wundheilung auf [7]. Zur Behandlung von Verschlüssen großer Gefäße bei schwerer pAVK wird in der Regel eine chirurgische Revaskularisierung durchgeführt, bei ausgedehnter und/oder kleiner Gefäßischämie (2–5 mm Gefäßdurchmesser) werden jedoch vor allem angiogene medikamentöse Behandlung und Regenerationstherapie eingesetzt [8]. Die Bildung neokapillärer Gefäße und die umgestaltete Reaktion sind an der Wiederherstellung des Blutflusses zum ischämischen Gewebe beteiligt. Daher ist das therapeutische Potenzial der neuen Neovaskularisierungsstrategie für die diabetische Vaskulopathie dringend erforderlich.

Der Chemokin-CXC-Motivligand 5 (CXCL5), auch bekannt als epitheliales Neutrophilen-aktivierendes Peptid, ist ein Chemokin, das hauptsächlich an der Chemotaxis von Entzündungszellen beteiligt ist [9, 10]. CXCL5 fördert die Migration von Neutrophilen und aktiviert die Entzündungsreaktion durch den Chemokin-CXC-Motivrezeptor 2 (CXCR2) [11]. Der CXCL5-Spiegel war in Mausmodellen von DM und im klinischen Umfeld erhöht [12,13,14,15,16]. CXCL5 könnte eine Insulinresistenz induzieren, indem es den Insulinsignalweg in Muskeln, Fettgewebe und Makrophagen hemmt. Erhöhte CXCL5-Spiegel gingen mit einer beeinträchtigten Inselfunktion einher [17]. Die Hemmung von CXCL5 durch neutralisierende Antikörper könnte die Insulinsensitivität und die Glukoseclearance bei insulinresistenten, adipösen Mäusen verbessern [18, 19]. Insgesamt kann CXCL5 bei DM erhöht und an der Entstehung und dem Fortschreiten von Gefäßerkrankungen beteiligt sein.

Theoretisch könnte CXCL5 zu den vaskulären Komplikationen bei Diabetes beitragen, obwohl der direkte Zusammenhang und der detaillierte Mechanismus noch nicht geklärt sind. Angesichts der klinischen Bedeutung der diabetischen Vaskulopathie zielte diese Studie darauf ab, die möglichen Auswirkungen und mechanistischen Erkenntnisse von CXCL5 bei der diabetischen Vaskulopathie zu untersuchen. Serielle In-vitro- und In-vivo-Versuchsmodelle wurden verwendet, um zu bewerten, ob eine direkte Hemmung durch neutralisierende Antikörper oder ein Mangel an CXCL5 durch genetisches Knockout die diabetesbedingte Vaskulopathie verbessern könnte. Die Ergebnisse könnten die potenzielle Rolle von CXCL5 als neues therapeutisches Ziel für diabetische Vaskulopathie unterstützen.

Die Blutprobe wurde aus den peripheren Venen von Patienten mit Typ-2-DM und Nicht-DM-Patienten entnommen. Es wurden nur stabile Typ-2-DM-Patienten ohne Insulinbehandlung eingeschlossen. Patienten mit anderen schwerwiegenden systemischen Erkrankungen, die sich in den letzten 6 Monaten einer größeren Operation unterzogen hatten oder sich derzeit wegen anderer Krankheiten in ärztlicher Behandlung befanden, wurden ausgeschlossen. Bei der Einschreibung wurden demografische und klinische Daten erhoben. Die Einverständniserklärung aller in die Studie einbezogenen Einzelteilnehmer wurde eingeholt. Die Humanstudie wurde vom Forschungsausschuss des Instituts genehmigt und entsprach der Deklaration von Helsinki. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Taipei Veterans General Hospital (IRB-2018-01-001AC) genehmigt.

Nach der Blutentnahme wurden die gesamten mononukleären Zellen mit Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, 10771, Darmstadt, Deutschland) abgetrennt und 30 Minuten lang bei 500 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die mononukleären Zellen wurden in Endothelzell-Basalmedium (Lonza, CC-3156, Basel, Schweiz) mit Zusätzen wie Hydrocortison, menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), R3-Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1, kultiviert. Ascorbinsäure, humaner epidermaler Wachstumsfaktor, Gentamicinsulfat-Amphotericin und 20 % fötales Rinderserum auf Fibronektin-beschichteten 6-Well-Platten. Nach 2–4 Wochen Kultur hatten die befestigten EPCs die Form von Kopfsteinpflaster, und diese Form ist das typische Monoschicht-Wachstumsmuster reifer Endothelzellen. Menschliche Aortenendothelzellen (HAECs; ScienCell, Katalog Nr. 6100, Carlsbad, CA, USA) wurden mit Endothelzellmedium, das VEGF und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt (Sigma-Aldrich, P4333, Darmstadt, Deutschland), kultiviert und die Kulturschalen beschichtet mit Fibronektin vor Gebrauch. Um die Hyperglykämie bei DM nachzuahmen, verabreichten wir EPCs von Nicht-DM-Probanden oder HAECs zwei Tage lang 25 mM hohe Glukose (HG). Einige Zellen wurden mit monoklonalem CXCL5-Antikörper (1 oder 10 μg/ml; R&D Systems, MAB-254, Minneapolis, MN, USA) oder rekombinantem menschlichem CXCL5-Protein (1 oder 10 ng/ml; R&D Systems, 254-XB, Minneapolis) behandelt , MN, USA). Die Zellen wurden in Kulturmedium, ergänzt mit fötalem Rinderserum (5 % v/v Endkonzentration), in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 °C gezüchtet.

In einem anderen Teil der Studie wurden die folgenden Inhibitoren zur Erforschung der Signalwege verwendet: ein Inhibitor der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) (10 μM; U0126; Cayman Chemical Company, Nr. 70970, Ann Arbor, MI, USA) und ein selektiver CXCR2-Antagonist (10 oder 100 nM; SB332235; Cayman Chemical Company, Nr. 32869, Ann Arbor, MI, USA). Die oben genannten Reagenzien wurden 1 Stunde vor der Verabreichung des rekombinanten menschlichen CXCL5-Proteins zugegeben.

Die Konzentration von CXCL5 wurde mit einem ELISA-Kit (R&D Systems, DX000 und MX000, Minneapolis, MN, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Um die Fähigkeit der Zellen zur Basalzellmigration zu bewerten, wurden die Zellen (1 × 104 Zellen) in der oberen Kammer einer 24-Well-Transwellplatte mit Polycarbonatmembran ausgesät. Dann wanderten die Zellen in die untere Kammer, die 600 μl Kulturmedium mit FBS bei 37 °C in 5 % CO2 enthielt. Nach 18 Stunden wurden die migrierten Zellen in 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit Hämatoxylinlösung angefärbt. Die Bilder wurden mit einem Hochleistungsmikroskop (100-fach) aufgenommen.

Die Zellen (1 × 104 Zellen) wurden in ECMatrix-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in 96-Well-Platten in 100 μl Kulturmedium mit 10 % FBS für 16 Stunden bei 37 °C in 5 % CO2 ausgesät. Die Bilder wurden mit einem Hochleistungsmikroskop (40x) aufgenommen. Die Anzahl der gebildeten Zellnetzwerke wurde mit Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc. Rockville, MD, USA) berechnet.

Gesamtzell- oder Gewebelysate wurden mit Lysepuffer extrahiert und die Proteine ​​wurden in 8–12 % (v/v) SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt. Nach der Elektrophorese (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) wurden die Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Millipore, Darmstadt, Deutschland) übertragen und die Membranen mit Anti-VEGF (Santa Cruz Biotechnology, sc-152, Dallas, TX, USA), Anti-Stroma Cell-Derived Factor (SDF)-1 (Cell Signaling Technology, 3530S, Boston, MA, USA), Anti-Interleukin (IL)-1β (Santa Cruz Biotechnology, sc-52012, Dallas, TX, USA), Anti-IL-6 (Santa Cruz Biotechnology, sc-1265, Dallas, TX, USA), Antitumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α (Santa Cruz Biotechnology, sc-52746, Dallas, TX, USA). ), Anti-p-ERK (Cell Signaling, 9106S, Boston, MA, USA), Anti-ERK (Cell Signaling, 9102S, Boston, MA, USA), Anti-CXCR2 (Santa Cruz Biotechnology, sc-7304, Dallas, TX, USA), Anti-CXCL5 (R&D, MAB254, Minneapolis, MN, USA), Anti-p-p65 (Cell Signaling Technology, #3031S, Danvers, MA, USA), Anti-p65 (BD, 0079008, East Rutherford , NJ) und Anti-Actin (Merck, 3423208, Darmstadt, Deutschland) um 4 Uhr über Nacht. Nach dreimaligem Waschen wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (1:1000) inkubiert. Abschließend wurden die Membranen mit dem ECL-Kit sichtbar gemacht.

HAECs wurden mit CXCL5 1 oder 10 ng/ml rekombinantem Protein (R&D, 254-XB, Minneapolis, MN, USA) 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden auf Eis gekühlt und Zellextrakte mit Lysepuffer (1 % Triton X-100, 2,5 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 % Glycerin, 1 mM PMSF, pH 7,4) hergestellt. Die Lysate wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 13.000 U/min geklärt und mit Anti-CXCR2 (Santa Cruz Biotechnology, sc-7304, Dallas, TX, USA), das an Agarosekügelchen gebunden war, über Nacht bei 4 ° C auf einer Schaukel inkubiert. Anschließend wurden die Perlen durch 3-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min bei 4 °C gesammelt und ausgiebig in Lysepuffer gewaschen. Die Proteine ​​wurden auf einem 12 %igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Immunblotting mit den entsprechenden Antikörpern analysiert.

Ätiologisch unterschiedliche präklinische Modelle wurden unabhängig voneinander verwendet. Sechs Wochen alte männliche FVB/NCrlBltw-Mäuse wurden von BioLASCO (Taipeh, Taiwan) gekauft. Mäusen wurde 5 Tage lang intraperitoneal 40 mg/kg Streptozotocin (STZ; Sigma-Aldrich, S0130, Darmstadt, Deutschland) injiziert. Das Experiment begann, als der Blutzuckerspiegel der Mäuse mehr als 250 mg/dl betrug. Sechs Wochen alte männliche BKS.Cg-m+/+Leprdb/JNarl-Mäuse wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) gekauft. Alle Mäuse wurden vor den Experimenten zwei Wochen lang akklimatisiert. Zur Behandlung von Ischämieoperationen an den Hinterbeinen wurde Mäusen dreimal intraperitoneal der monoklonale CXCL5-Antikörper (R&D, MAB433, Minneapolis, MN, USA) oder der monoklonale IgG-Antikörper (R&D, MAB0061, Minneapolis, MN, USA) in einer Menge von 10 oder 100 μg injiziert Woche für einen Monat.

Sechs Wochen alte männliche C57BL/6JNarl-Cxcl5em1-Knockout-Mäuse wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) entworfen und gekauft. CXCL5-Knockout-Mäuse (CXCL5KO) wurden mit einem C57BL/6JNarl-Genhintergrund unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems hergestellt. Insgesamt wurden befruchtete Embryonen von C57BL/6JNarl-Mäusen mit sgRNAs und Cas9-mRNA mikroinjiziert. Für phänotypische Analysen parallel zu alters- und geschlechtsangepassten Wildtyp-Wurfgeschwistern (WT) wurden homozygote Knockout-Mäuse aus einer heterozygoten Kreuzung erzeugt. Alle Mäuse wurden mittels PCR mit spezifischen Primern (vorwärts, 5'-TCTTAAAGGTTGAGCCATCTCCC-3' und rückwärts, 5'-CCCATTATGATCTAAATCCCCACC-3') genotypisiert. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen aufgezogen und in Mikroisolatorkäfigen mit 12:12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklen und freiem Zugang zu Wasser und Standard-Mäusefutter gehalten. Mäusen wurde 5 Tage lang intraperitoneal 40 mg/kg STZ injiziert. Das Experiment begann, als ihr Blutzuckerspiegel über 250 mg/dl lag. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Yang Ming Chiao Tung University (IACUC Nr. 1091104) genehmigt.

Die einseitige Ischämieoperation der Hinterbeine wurde in unserer vorherigen Veröffentlichung verwendet [20]. Um genau zu sein, wurden Mäuse durch Inhalation von 3 % Isofluran betäubt und einmal pro Woche 10 Minuten lang exponiert. Anschließend wurden die Mäuse rasiert und die Operationsstelle mit 70 %igem Ethanol gereinigt. Die Oberschenkelarterie und -vene wurden vom Oberschenkelnerv getrennt und der proximale und distale Teil der rechten Oberschenkelarterie sowie der distale Teil der rechten Saphena-Arterie wurden abgebunden. Anschließend wurden die Arterien und alle Seitenäste freipräpariert und herausgeschnitten. Die Haut wurde mit einer nicht durchgehenden Naht verschlossen. Der Ischämie-Blutfluss der Hinterbeine wurde durch Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung (Moor Instruments Limited, Devon, UK) an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 28 nach der Operation analysiert. Die Reperfusionsrate im Hinterbein wurde für jede Maus als Verhältnis des Blutflusses im ischämischen Glied im Vergleich zum nicht-ischämischen Glied berechnet. Alle Mäuse wurden durch inhaliertes Isofluran anästhesiert und 28 Tage nach der ischämischen Operation durch Ausbluten des Herzens getötet. Der Gastrocnemius-Muskel jedes Beins wurde für immunhistochemische oder Proteinexpressionsanalysen entnommen.

Die mononukleären Zellen des peripheren Blutes wurden in Kochsalzlösung suspendiert und mit Fluoresceinisothiocyanat-Anti-Maus-Stammzellen-Antigen (Sca)-1 (Invitrogen, 11-5981-82, Carlsbad, CA, USA) und Phycoerythrin-Anti-Maus-Rezeptor für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor inkubiert 2, auch bekannt als Flk-1 (Invitrogen, 12-5821-82, Carlsbad, CA, USA) bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Es wurde ein BD FACScalibur-Durchflusszytometer (BD, East Rutherford, NJ) verwendet und die Daten wurden mit FloJo (Treestar) analysiert. Die Daten werden als %-gesteuert, relativ zur Kontrollgruppe, dargestellt.

EPCs wurden geerntet und gewaschen, bevor sie für die Durchflusszytometrie in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert wurden. Zur Identifizierung der Eigenschaften von EPCs wurden VE-Cadherin (Biolegend, 348505, San Diego, CA), CD31 (Biolegend, 303117, San Diego, CA), CD34 (BD, 555821, East Rutherford, NJ), KDR (R&D, FAP357) verwendet , Minneapolis, MN, USA), CD133 (MACS, 130-111-756, Deutschland), CD3 (Biolegend, 300407, San Diego, CA), CD68 (Biolegend, 333805, San Diego, CA), CD86 (Biolegend, 374203 Es wurden die Antikörper CD163 (Biolegend, 33605, San Diego, CA) und CD206 (Biolegend, 321123, San Diego, CA) verwendet. Die Zellen wurden mit dem BD FACScalibur-Durchflusszytometer (BD, East Rutherford, NJ) analysiert und die Daten wurden mit FloJo (Treestar) analysiert. Die Daten werden als %-Gated dargestellt.

Der Aortenringtest wurde in unserer früheren Veröffentlichung verwendet [21]. Aortenringe wurden dann auf 0,5 mm geschnitten und in 1 mg/ml Typ-1-Rattenschwanzkollagenmatrix (Millipore, 08115, Darmstadt, Deutschland) eingebettet und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Aortenringe wurden unter Verwendung von Endothelzellwachstums-Basalmedium-2 (Lonza, Bend, OR, USA) mit Zusätzen (Hydrocortison, menschliche Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, VEGF, R3-Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-1, Ascorbinsäure, menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor) kultiviert , Gentamicinsulfat-Amphotericin) mit 2,5 % fötalem Rinderserum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 50 U/ml Penicillin, 0,5 mg/ml Streptomycin (Sigma-Aldrich, P4333, Darmstadt, Deutschland) und 30 ng/ml VEGF (Peprotech, 100-20, Rocky Hill, CT, USA) in 24-Well-Platten für 7 Tage. Nach der Kultur wurden die Aortenringe mit Fluoresceinisothiocyanat-Anti-Lectin B4 (Sigma-Aldrich, L9006, Darmstadt, Deutschland) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (100×) aufgenommen.

Der Matrigel-Plug-Neovaskularisationstest wurde in unserer vorherigen Veröffentlichung verwendet [22]. Im Detail wurden Mäuse durch Inhalation von 3 % Isofluran anästhesiert und in diesem Test 10 Minuten lang exponiert. Den Mäusen wurde subkutan eine wachstumsfaktorreduzierte (GFR) Basalmembranmatrix (Corning® Matrigel, 356231, Glendale, AZ, USA) injiziert, die 30 ng/ml VEGF (Peprotech, 100-20, Rocky Hill, CT, USA) und 50 U enthielt /ml Heparin (Sigma-Aldrich, H3393, Darmstadt, Deutschland). Das Gel bildete einen festen Pfropfen, als es die Körpertemperatur erreichte. Nach 14 Tagen wurden die Pfropfen gesammelt und mit 500 μl Zelllysepuffer homogenisiert und 60 Minuten lang bei 6000 × g und 4 °C zentrifugiert. Ein kolorimetrischer Assay (Sigma-Aldrich, MAK115, Darmstadt, Deutschland) wurde verwendet, um Hämoglobin mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 400 nm nachzuweisen. Der Pfropfen wurde zur histologischen und immunhistochemischen Analyse entnommen.

Der Wundheilungstest wurde in unserer vorherigen Veröffentlichung verwendet [22]. Um genau zu sein, wurden Mäuse durch Inhalation von 3 % Isofluran anästhesiert und in diesem Test 3 Minuten lang exponiert. Die Rückenhaut wurde rasiert und mit antibakterieller Seifenlösung und 70 % Ethanol gereinigt. Kreisförmige Exzisionswunden in voller Dicke mit einem Durchmesser von 3 mm wurden durch Biopsie-Stanzung ohne Muskelverletzung erzeugt. Wunden wurden mit einer Digitalkamera (Nikon, Tokio, Japan) 0, 1, 3, 5 und 8 Tage nach ihrer Entstehung aufgezeichnet.

Die Gewebeprobe wurde 24 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in abgestuften Alkoholen dehydriert und dann in Paraffinwachs eingebettet. Die Gewebe wurden in Proben mit einer Dicke von 5 μm geschnitten. Die Schnitte wurden über Nacht getrocknet und zur histologischen Analyse mit Hämatoxylin und Eosin sowie Massons Trichrom-Färbung gefärbt. In Paraffinwachs eingebettete Gewebe wurden in 5 μm Dicke geschnitten und rehydriert. Die Antigengewinnung wurde unter Verwendung von 0,05 M Natriumcitratpuffer durchgeführt. Die Objektträger wurden dann über Nacht bei 4 °C mit dem primären Antikörper zum Nachweis von CD31 (Abcam, 124432, Waltham, MA, USA) inkubiert. Die Probe wurde mit PBS-Lösung gewaschen und mit einem sekundären Antikörper (Kaninchen) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Bei der Masson-Trichrom-Färbung wurden in Paraffinwachs eingebettete Gewebe mit einer Dicke von 3 μm geschnitten und 10 Minuten lang mit Weigerts Eisenhämatoxylin-Arbeitslösung gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte 15 Minuten lang mit Biebrich-Scharlachsäure-Fuchsinlösung und Phosphomolybdän-Phosphowolframsäure-Lösung gefärbt. Abschließend wurden die Schnitte für 10 Minuten in Anilinblaulösung überführt.

Nach 4-stündigem Fasten wurde 1 μl Mäuseblut aus dem Schwanz entnommen. Es wurde ein Abbott FreeStyle-Glukometer (Abbot-OPTIUM XCEED) gemäß den Anweisungen des Originalherstellers verwendet.

Aufgrund der nichtparametrischen Natur unserer Daten verwendeten wir den Median und das Interquartil für deskriptive Statistiken und den Mann-Whitney-U-Test, um Gruppenunterschiede zu identifizieren. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die CXCL5-Konzentration war im Plasma von Patienten mit Typ-2-DM im Vergleich zu Nicht-DM-Patienten erhöht (Abb. 1A). Die CXCL5-Konzentration im Kulturmedium von EPCs von Typ-2-DM-Patienten war im Vergleich zu Nicht-DM-Patienten erhöht (Abb. 1B). Klinische Merkmale der Studienpopulation wurden gezeigt (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Die in dieser Studie verwendeten EPCs waren positiv für vaskuläre Endothelzellmarker wie VE-Cadherin, CD31, CD34, KDR, CD133 und negativ für Makrophagenmarker wie CD3, CD68, CD86, CD163 und CD206 (Zusatzdatei 1: Abb . S1). Die Verabreichung von neutralisierendem CXCL5-Antikörper in Mengen von 10 µg/ml reparierte die Netzwerkbildungs- und Migrationsfähigkeiten von EPCs von Typ-2-DM-Patienten (Abb. 1C, D). Die Behandlung mit neutralisierendem CXCL5-Antikörper bei 10 µg/ml verstärkte die Proteinexpression von VEGF und SDF-1 in EPCs von Typ-2-DM-Patienten (Abb. 1E). Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der neutralisierende CXCL5-Antikörper die VEGF- und SDF-1-Proteinexpression erhöhen könnte, um die Migration und In-vitro-Angiogenesefähigkeit von EPCs von Typ-2-DM-Patienten zu fördern.

Die Behandlung mit dem neutralisierenden Antikörper CXCL5 steigerte die VEGF/SDF-1-Expression und förderte die Angiogenese in späten EPCs von Typ-2-DM-Patienten. Plasmaspiegel von CXCL5 bei Typ-2-DM-Patienten und Nicht-DM-Patienten (n = 6; A). EPCs mittlere CXCL5-Spiegel bei Typ-2-DM-Patienten und Nicht-DM-Patienten (n = 6; B). Die Netzwerkbildungs- und Migrationsfähigkeiten wurden nach der Verabreichung von CXCL5-mAb in EPCs von Typ-2-DM-Patienten verbessert (n = 3; C, D). Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 in EPCs von Typ-2-DM-Patienten (n = 3; E). CXCL5-Chemokin-CXC-Motivligand 5, DM-Diabetes mellitus, endotheliale EPC-Vorläuferzelle, monoklonaler mAb-Antikörper, SDF-1-Stromazellen-abgeleiteter Faktor 1, VEGF-vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor. N stellt Zellen dar, die von n verschiedenen Individuen kultiviert wurden, und die von jedem Individuum kultivierten Zellen wurden für drei unabhängige Experimente untersucht. Zur Bestimmung statistisch signifikanter Unterschiede wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01

Die Behandlung mit CXCL5-neutralisierendem Antikörper in einer Konzentration von 10 µg/ml reparierte die Netzwerkbildungs- und Migrationsfähigkeiten von HG-stimulierten EPCs von Nicht-DM-Probanden (Abb. 2A, B). Die Verabreichung von CXCL5-neutralisierendem Antikörper in Dosen von 10 µg/ml erhöhte die Proteinexpression von VEGF und SDF-1 in HG-stimulierten EPCs von Nicht-DM-Probanden (Abb. 2C). Andererseits reparierten Behandlungen mit CXCL5-neutralisierendem Antikörper bei 10 µg/ml die Fähigkeit der In-vitro-Angiogenese und -Migration unter den HG-Bedingungen (Abb. 2D, E). Unterdessen erhöhte die Verabreichung des neutralisierenden CXCL5-Antikörpers mit 10 µg/ml die Proteinexpression von VEGF und SDF-1 in HG-stimulierten HAECs im Vergleich zur HG-Gruppe (Abb. 2F). Diesen Ergebnissen zufolge erhöhte die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper die VEGF- und SDF-1-Proteinexpression, um die beeinträchtigte Migration und In-vitro-Angiogenesefähigkeit von EPCs und HAECs unter den HG-Stimulationen zu reparieren.

Die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper regulierte die VEGF/SDF-1-Expression hoch und förderte die Angiogenese in späten EPCs von Nicht-DM-Probanden und HAECs unter den HG-Bedingungen. Die Netzwerkbildungs- und Migrationsfähigkeiten wurden nach der Verabreichung von CXCL5-mAb in EPCs von Nicht-DM-Probanden verbessert (n = 3; A, B). Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 in EPCs von Nicht-DM-Probanden (n = 3; C). Die Netzwerkbildungs- und Migrationsfähigkeiten wurden nach der Verabreichung von CXCL5-mAb in HAECs verbessert (n = 3; D, E). Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 in HAECs (n = 3; F). CXCL5 CXC-Motiv-Chemokinligand 5, EPC-Endothel-Vorläuferzelle, HG-Hochglukose, HAEC-humane Aorten-Endothelzelle, mAb, monoklonaler Antikörper, SDF-1-Stromazellen-abgeleiteter Faktor 1, VEGF-Gefäß-Endothel-Wachstumsfaktor. N stellt die Anzahl unabhängiger Experimente an verschiedenen Tagen und in verschiedenen Versuchsdurchläufen dar. Zur Bestimmung statistisch signifikanter Unterschiede wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01

Die Verabreichung von CXCL5 beeinträchtigte die Netzwerkbildung und Migrationsfähigkeiten in HAECs (Abb. 3A, B). Die Phosphorylierung von ERK und p65 wurde durch die Verabreichung von CXCL5 in HAECs erhöht (Abb. 3C). Darüber hinaus wurden die nachgeschalteten Entzündungsproteine, einschließlich IL-1β, IL-6 und TNF-α, durch CXCL5-Behandlungen aktiviert (Abb. 3D). Andererseits wurde die angiogene Proteinexpression wie VEGF und SDF-1 durch CXCL5-Behandlungen reduziert (Abb. 3E). Die CXCL5-induzierte Phosphorylierung von p65 und seinen nachgeschalteten Entzündungsproteinen, einschließlich IL-1β, IL-6 und TNF-α, wurde durch die Verabreichung von U0126, einem ERK-Inhibitor, für 30 Minuten bzw. 4 Stunden verringert (Zusatzdatei 1: Abb . S2A). Nach zweitägiger Verabreichung von U0126 wurde die verminderte SDF-1- und VEGF-Expression durch CXCL5 umgekehrt (Zusatzdatei 1: Abb. S2B).

CXCL5 beeinträchtigte die vaskuläre Endothelfunktion über den ERK/p65-Signalweg in HAECs. Die Netzwerkbildungs- und Migrationsfähigkeiten waren nach 2-tägiger Verabreichung von CXCL5 beeinträchtigt (n = 3; A, B). Western Blot und statistische Analysen von p-ERK, p-p65, IL-1β, IL-6 und TNF-α nach 2-tägiger Verabreichung von CXCL5 (n = 3; C, D). Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 nach Verabreichung von CXCL5 über 2 Tage (n = 3; E). Western Blot von CXCR2 und CXCL5 nach Anti-Ziegen-IgG- und CXCR2-Immunpräzipitation (n = 3; F). CXCL5 Chemokine CXC-Motivligand 5, CXCR2 Chemokine CXC-Motivrezeptor 2, extrazelluläre signalregulierte ERK-Kinase, HAEC menschliche Aortenendothelzelle, IL-Interleukin, SDF-1-Stromazellen-abgeleiteter Faktor 1, TNF-α-Tumornekrosefaktor-α, VEGF vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor. N stellt die Anzahl unabhängiger Experimente an verschiedenen Tagen und in verschiedenen Versuchsdurchläufen dar. Zur Bestimmung statistisch signifikanter Unterschiede wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01

Die Immunpräzipitationsanalyse zeigte, dass CXCL5 mit CXCR2 interagieren könnte (Abb. 3F). Das CXCL5-induzierte p-ERK, IL-1β, IL-6 und TNF-α wurden durch die 4-stündige Verabreichung von SB332235, einem CXCR2-Antagonisten, verringert (Zusatzdatei 1: Abb. S2C). Darüber hinaus wurde die verringerte VEGF- und SDF-1-Expression durch CXCL5-Behandlungen nach 2 Tagen der Verabreichung von SB332235 umgekehrt (Zusatzdatei 1: Abb. S2D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CXCL5 die Zellfunktion beeinträchtigen und über die ERK/p65-Aktivierung durch CXCR2 entzündungsfördernde und antiangiogene Wirkungen ausüben könnte.

Diabetische Mäuse hatten ein geringeres Körpergewicht und einen deutlich höheren Blutzucker. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht und im Blutzucker zwischen den mit CXCL5-mAb behandelten Mäusen und den unbehandelten Diabetikern (Zusatzdatei 1: Abb. S3A, B). Die Serum-CXCL5-Spiegel waren bei STZ-induzierten diabetischen Mäusen hochreguliert und bei den mit CXCL5-mAb behandelten Mäusen verringert (Abb. 4A). Der Blutfluss im ischämischen Hinterbein war nach einer Ischämieoperation am Hinterbein in jeder Gruppe von Mäusen gleichermaßen verringert. Der Blutfluss wurde durch Behandlung mit neutralisierendem CXCL5-Antikörper bei 100 μg im Vergleich zur DM-Gruppe repariert (Abb. 4B). Nach einer Ischämieoperation an den Hinterbeinen wurde die Anzahl der im Umlauf befindlichen EPCs durch die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper im Vergleich zu den Behandlungsgruppen DM und DM mit IgG-Antikörpern hochreguliert (Abb. 4C). Darüber hinaus zeigte der ischämische Gastrocnemius-Muskel eine erhöhte Kapillardichte in der mit 100 μg CXCL5 neutralisierenden Antikörpern behandelten Gruppe (Abb. 4D). Die Proteinexpression von VEGF und SDF-1 im ischämischen Gastrocnemius-Muskel war nach 4-wöchiger Behandlung im Vergleich zu den Behandlungsgruppen DM und DM mit IgG-Antikörpern um 100 μg neutralisierender CXCL5-Antikörper erhöht (Abb. 4E).

Der neutralisierende CXCL5-Antikörper reparierte die Neovaskularisation und Wundheilung bei Typ-1-DM-Mäusen. Die Serum-CXCL5-Spiegel waren bei den diabetischen Mäusen höher als bei der Nicht-DM-Kontrolle. Die Behandlung mit CXCL5-mAb reduzierte die CXCL5-Spiegel (n = 6; A). Repräsentative Bewertung der ischämischen (rechts) und nicht-ischämischen (linken) Hinterbeine vor, unmittelbar nach 2 Wochen und 4 Wochen nach der Ischämieoperation der Hinterbeine bei STZ-induzierten Typ-1-Diabetikermäusen (n = 6; B). Die Anzahl der zirkulierenden EPCs wurde durch Durchflusszytometrie in STZ-induzierten Typ-1-Diabetikermäusen bestimmt. Die Behandlung mit CXCL5 mAb 100 μg erhöhte die Anzahl zirkulierender EPCs nach einer Ischämieoperation im Vergleich zu DM (n = 6; C). Die Anti-CD31-Immunfärbung zeigte, dass die Behandlung mit CXCL5 mAb 100 μg die Anzahl der Kapillaren signifikant erhöhte. Maßstabsbalken, 50 µm (n = 6; D) Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 im Ischämiebein (n = 3; E). Die Angiogenese in Aortenringkulturen von CXCL5-mAb-100-μg-Mäusen war im Vergleich zu DM-Mäusen deutlich erhöht, da die Anzahl der Gefäße spross. Maßstabsbalken, 50 µm (n = 3; F). Repräsentative Matrigel-Plug-Bilder und Analyse des Hämoglobingehalts (n = 6; G). Repräsentative Matrigel-Plug-Bilder mit Immunfärbung von CD31. CD31-positive Bereiche waren bei Mäusen, die mit CXCL5 mAb 100 μg behandelt wurden, verstärkt. Maßstabsbalken, 50 µm (H). Die Behandlung mit CXCL5 mAb 100 μg verbesserte die Wundreparaturfähigkeit bei Mäusen mit STZ-induziertem Typ-1-Diabetes. Es wurden repräsentative Wundbereiche und die Verschlussraten von 3-mm-Stanzbiopsien gemessen (n = 6; I). Repräsentative Bilder des Wundbereichs mit Immunfärbung von CD31. CD31-positive Bereiche wurden in den mit CXCL5 100 μg mAb behandelten Mäusen verstärkt. Maßstabsbalken, 50 µm (J). Repräsentative Hautbilder mit Masson-Trichrom-Färbung. Die Kollagenablagerungen waren bei Mäusen, die mit CXCL5 mAb 100 μg behandelt wurden, verstärkt. Maßstabsbalken, 50 und 500 µm (K). CXCL5 Chemokine CXC-Motivligand 5, DM-Diabetes mellitus, endotheliale EPC-Vorläuferzelle, monoklonaler mAb-Antikörper, STZ Streptozotocin, SDF-1-Stromazellen-abgeleiteter Faktor 1, VEGF-Gefäßendothelwachstumsfaktor. Zur Bestimmung statistisch signifikanter Unterschiede wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zur Nicht-DM-Kontrolle. #p < 0,05, ##p < 0,01 im Vergleich zur unbehandelten DM-Gruppe

Darüber hinaus wurden komplexere In-vivo-Studienmodelle wie der Aortic Sprouting Ring Assay und der Matrigel Plug Assay verwendet, um die angiogenen Auswirkungen der CXCL5-Hemmung bei Typ-1-DM zu bestätigen. Der Aortenringtest hatte ursprüngliche Gefäßeigenschaften. Allerdings war die Aortensprossung in den Aortenringen der mit DM- und IgG-Antikörpern behandelten Mäuse offensichtlich beeinträchtigt. Die Verabreichung von neutralisierenden CXCL5-Antikörpern förderte das Keimen von Gefäßen im Vergleich zu den Behandlungsgruppen mit DM- und IgG-Antikörpern (Abb. 4F). Im Matrigel-Plug-Assay erhöhte die Verabreichung von neutralisierendem CXCL5-Antikörper in einer Menge von 100 μg den Hämoglobingehalt und die Kapillardichte im Vergleich zur unbehandelten DM-Gruppe (Abb. 4G, H). Es wurden auch repräsentative Matrigel-Plug-Bilder mit H&E-Färbung gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S3C).

Nach einer Biopsie konnte eine kutane Wundheilung an der Rückenhaut nachgewiesen werden. Der Wundverschluss war in der Nicht-DM-Kontrollgruppe nach 5 Tagen im Wesentlichen abgeschlossen. Die Behandlung mit neutralisierendem CXCL5-Antikörper bei 100 μg erhöhte den Prozentsatz des Wundverschlusses im Vergleich zu den Behandlungsgruppen DM und DM mit IgG-Antikörpern nach 3 Tagen (Abb. 4I). Es wurden auch repräsentative Bilder des Wundbereichs mit H&E-Färbung gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S3D). Darüber hinaus erhöhte die Verabreichung des neutralisierenden CXCL5-Antikörpers die Anzahl der CD31-positiven Gefäße und die akkumulierte Kollagenablagerung im Wundbereich im Vergleich zur DM-Gruppe und der Behandlungsgruppe mit IgG-Antikörpern (Abb. 4J, K). Insgesamt gibt es starke Belege dafür, dass die Hemmung von CXCL5 die Neovaskularisation bei Typ-1-DM-Mäusen verbessern könnte.

Diabetische Mäuse hatten ein höheres Körpergewicht und einen höheren Blutzuckerspiegel. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht und im Blutzucker zwischen den mit CXCL5-mAb behandelten Mäusen und den unbehandelten Diabetikern (Zusatzdatei 1: Abb. S4A, B). Die Serum-CXCL5-Spiegel waren bei diabetischen Mäusen hochreguliert und bei den mit CXCL5-mAb behandelten Mäusen verringert (Abb. 5A). Nach einer Ischämieoperation an den Hinterbeinen wurde der Blutfluss durch die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper im Vergleich zur DM-Gruppe wiederhergestellt (Abb. 5B). Die Anzahl der im Umlauf befindlichen EPCs bei Nicht-DM-Mäusen war nach der Operation signifikant erhöht. Dennoch stieg die Anzahl der EPCs nach der Operation in den DM- und IgG-Antikörpergruppen nicht an, sondern war in der mit CXCL5-neutralisierenden Antikörpern behandelten Gruppe umgekehrt (Abb. 5C). Darüber hinaus war die Kapillardichte in der mit CXCL5-neutralisierenden Antikörpern behandelten Gruppe erhöht (Abb. 5D). Die Proteinexpression von VEGF und SDF-1 im ischämischen Gastrocnemius-Muskel war nach 4-wöchiger Behandlung im Vergleich zu den Behandlungsgruppen DM und DM mit IgG-Antikörpern um 100 μg neutralisierender CXCL5-Antikörper erhöht (Abb. 5E). Darüber hinaus könnte die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper den Hämoglobingehalt und die Gefäßbildung im Matrigel-Plug-Assay verbessern (Abb. 5F, G). Es wurden auch repräsentative Matrigel-Plug-Bilder mit H&E-Färbung gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S4C).

Die Neovaskularisation und Wundheilung wurden durch Neutralisierung von CXCL5-Antikörpern bei Typ-2-DM-Mäusen verbessert. Die Behandlung mit CXCL5-mAb reduzierte die CXCL5-Spiegel bei diabetischen Mäusen (n = 6; A). Repräsentative Bewertung der ischämischen (rechts) und nicht-ischämischen (linken) Hinterbeine vor, unmittelbar nach 2 Wochen und 4 Wochen nach der Hinterbein-Ischämie-Operation bei db/db-Mäusen (n = 6; B). Die Anzahl der zirkulierenden EPCs wurde durch Durchflusszytometrie in db/db-Mäusen bestimmt. Die Behandlung mit CXCL5 mAb 100 μg erhöhte die Anzahl zirkulierender EPCs nach einer Ischämieoperation im Vergleich zu DM (n = 6; C). Die Anti-CD31-Immunfärbung zeigte, dass die Behandlung mit CXCL5 mAb 100 μg die Anzahl der Kapillaren signifikant erhöhte. Maßstabsbalken, 50 µm (n = 6; D). Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 im Ischämiebein (n = 3; E). Repräsentative Matrigel-Plug-Bilder und Analyse des Hämoglobingehalts (n = 6; F). Repräsentative Matrigel-Plug-Bilder mit Immunfärbung von CD31. CD31-positive Bereiche waren bei Mäusen, die mit CXCL5 mAb 100 μg behandelt wurden, verstärkt. Maßstabsbalken, 50 µm (G). Die Behandlung mit CXCL5 mAb 100 μg verbesserte die Wundreparaturfähigkeit bei db/db-Mäusen. Es wurden repräsentative Wundbereiche und die Verschlussraten von 3-mm-Stanzbiopsien gemessen (n = 6; H). Repräsentative Bilder des Wundbereichs mit Immunfärbung von CD31. CD31-positive Bereiche waren bei Mäusen, die mit CXCL5 mAb 100 μg behandelt wurden, verstärkt. Maßstabsbalken, 50 µm (I). Die Serumkonzentration von VEGF und SDF-1 war bei den mit CXCL5 mAb 100 μg behandelten Mäusen höher (n = 6; J, K). CXCL5-Chemokin-CXC-Motivligand 5, DM-Diabetes mellitus, endotheliale EPC-Vorläuferzelle, monoklonaler mAb-Antikörper, SDF-1-Stromazellen-abgeleiteter Faktor 1, VEGF-vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor. Zur Bestimmung statistisch signifikanter Unterschiede wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zur Nicht-DM-Kontrolle. #p < 0,05, ##p < 0,01 im Vergleich zur unbehandelten DM-Gruppe

Im Wundheilungstest förderte die Behandlung mit neutralisierenden CXCL5-Antikörpern den Wundverschluss im Vergleich zu den Behandlungsgruppen DM und DM mit IgG-Antikörpern (Abb. 5H). Es wurden auch repräsentative Bilder des Wundbereichs mit H&E-Färbung gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S4D). Die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper erhöhte die Gefäßzahlen im Wundbereich (Abb. 5I). Die Hemmung von CXCL5 erhöhte den VEGF- und SDF-1-Spiegel im Serum (Abb. 5J, K). Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass die Hemmung von CXCL5 die Neovaskularisation bei Typ-2-DM-Mäusen verbessern könnte.

Diabetische Mäuse hatten ein geringeres Körpergewicht und einen deutlich höheren Blutzucker. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht und im Blutzucker zwischen den CXCL5KO-diabetischen Mäusen und den WT-diabetischen Mäusen (Zusatzdatei 1: Abb. S5A, B). CXCL5-Knockout-Mäuse hatten selten zirkulierendes CXCL5 (Abb. 6A). Um die Rolle von CXCL5 bei der diabetischen Angiogenese zu verifizieren, wurde STZ verwendet, um Typ-1-DM in CXCL5KO-Mäusen zu induzieren. Vier Wochen nach der Ischämieoperation an den Hinterbeinen zeigte die STZ-Gruppe eine schlechte Erholung des Blutflusses. Wichtig ist, dass die Wiederherstellung des Blutflusses in der CXCL5KO+STZ-Gruppe besser war als in der WT+STZ-Gruppe (Abb. 6B). Nach der Operation war die Anzahl der im Umlauf befindlichen EPCs in der WT+STZ-Gruppe nicht erhöht, in der CXCL5+STZ-Gruppe jedoch erhöht (Abb. 6C). Die CXCL5KO+STZ-Gruppe zeigte im Vergleich zur WT+STZ-Gruppe eine höhere Kapillardichte im ischämischen Gastrocnemius-Muskel (Abb. 6D). Die Proteinexpression von VEGF und SDF-1 im ischämischen Gastrocnemius-Muskel war in der CXCL5KO+STZ-Gruppe nach 4-wöchiger Behandlung im Vergleich zu den WT+STZ-Gruppen erhöht (Abb. 6E). Im Matrigel-Plug-Assay zeigte die CXCL5KO+STZ-Gruppe im Vergleich zu den WT+STZ-Gruppen auch einen erhöhten Hämoglobingehalt und eine erhöhte Gefäßbildung in den Matrigel-Plugs (Abb. 6F, G). Es wurden auch repräsentative Matrigel-Plug-Bilder mit H&E-Färbung gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S5C).

Die Neovaskularisation und Wundheilung wurden bei STZ-induzierten CXCL5KO-diabetischen Mäusen verbessert. CXCL5-Knockout-Mäuse hatten selten zirkulierendes CXCL5 (n = 6; A). Repräsentative Bewertung der ischämischen (rechts) und nicht-ischämischen (linken) Hinterbeine vor, unmittelbar nach 2 Wochen und 4 Wochen nach der Ischämieoperation der Hinterbeine bei STZ-induzierten Typ-1-Diabetikermäusen (n = 6; B). Die Anzahl der zirkulierenden EPCs wurde durch Durchflusszytometrie in STZ-induzierten Typ-1-Diabetikermäusen bestimmt. Die Löschung der CXCL5-Expression erhöhte die Anzahl zirkulierender EPCs nach einer Ischämieoperation im Vergleich zu DM (n = 6; C). Die Anti-CD31-Immunfärbung zeigte, dass die Hemmung der CXCL5-Expression die Anzahl der Kapillaren signifikant erhöhte. Maßstabsbalken, 50 µm (n = 6; D). Western Blot und statistische Analysen von VEGF und SDF-1 im Ischämiebein (n = 3; E). Repräsentativer Matrigel-Plug und Analyse des Hämoglobingehalts (n = 6; F). Repräsentative Matrigel-Plug-Bilder mit Immunfärbung von CD31. CD31-positive Bereiche waren bei CXCL5-Knockout-Diabetikermäusen verstärkt. Maßstabsbalken, 50 µm (G). Die CXCL5-Hemmung durch Knockout verbesserte die Wundreparaturfähigkeit bei STZ-induzierten Typ-1-Diabetikermäusen. Es wurden repräsentative Wundbereiche und die Verschlussraten von 3-mm-Stanzbiopsien gemessen (n = 6; H). Repräsentative Bilder des Wundbereichs mit Immunfärbung von CD31. CD31-positive Bereiche waren in den CXCL5-Knockout-Mäusen verstärkt. Maßstabsbalken, 50 µm (I). CXCL5, Chemokine CXC-Motivligand 5; CXCL5KO, CXCL5-Knockout-Mäuse; CXCL5KO+STZ, CXCL5-Knockout-Diabetikermäuse. DM-Diabetes mellitus, endotheliale EPC-Vorläuferzelle, STZ-Streptozotocin, WT-Wildtyp-Mäuse, WT+STZ-Wildtyp-Diabetikermäuse. Zur Bestimmung statistisch signifikanter Unterschiede wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zur WT-Gruppe. #p < 0,05, ##p < 0,01 im Vergleich zur WT+STZ-Gruppe

Im Wundheilungstest zeigte die CXCL5KO+STZ-Gruppe im Vergleich zur WT+STZ-Gruppe einen höheren Prozentsatz an Wundverschluss (Abb. 6H). Es wurden auch repräsentative Bilder des Wundbereichs mit H&E-Färbung gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S5D). Darüber hinaus wies die CXCL5KO+STZ-Gruppe eine erhöhte Gefäßzahl im Wundbereich auf (Abb. 6I). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein CXCL5-Mangel die Angiogenese und Neovaskularisation bei DM verbessern könnte.

Diese Forschung brachte eine Reihe interessanter und potenziell wichtiger Erkenntnisse hervor. Erstens setzten EPCs von Typ-2-DM-Patienten höhere Mengen an CXCL5 frei als jene von Nicht-DM-Patienten. Die Hemmung von CXCL5 durch neutralisierende Antikörper verbesserte die EPC-Funktion von Typ-2-DM-Patienten mit erhöhter VEGF- und SDF-1-Expression, und die Ergebnisse waren bei den HG-stimulierten HAECs und EPCs von Nicht-DM-Patienten dieselben. Darüber hinaus könnte CXCL5 direkt eine Schädigung der Endothelzellen induzieren und über die Hochregulierung von ERK/p65 durch CXCR2 entzündungsfördernde und antiangiogene Wirkungen ausüben. Zweitens verbesserte die systemische CXCL5-Unterdrückung die Wiederherstellung des Blutflusses nach einer Ischämieoperation an den Hinterbeinen, erhöhte die Anzahl der zirkulierenden EPCs und regulierte die VEGF- und SDF-1-Expression im ischämischen Gastrocnemius-Muskel bei DM-Mäusen. Drittens erhöhte die CXCL5-Unterdrückung nicht nur den Hämoglobingehalt und die Gefäßzahl im Matrigel-Plug-Assay, sondern erhöhte auch die Anzahl der aus der Aorta sprudelnden Gefäße im Aortenring-Assay bei DM-Mäusen. Viertens verbesserte die CXCL5-Unterdrückung den Wundverschlussbereich und die Kollagenansammlung im Wundbereich bei DM-Mäusen. Wichtig ist, dass CXCL5KO-Mäuse zur Erzeugung diabetischer Mäuse verwendet wurden, um unser Konzept weiter zu beweisen. In Übereinstimmung mit den obigen Beobachtungen hatten CXCL5KO-diabetische Mäuse im Vergleich zu gewöhnlichen diabetischen Mäusen eine verbesserte Angiogenese und Neovaskularisation in vivo. Zusammenfassend stützen unsere Ergebnisse die Annahme, dass CXCL5 eine entscheidende und mechanistische Rolle bei der diabetischen Vaskulopathie spielen könnte (Abb. 7).

Diese Ergebnisse stimmten mit denen früherer Studien überein, die signifikant erhöhte CXCL5-Spiegel in einem Mausmodell für Typ-2-DM und bei Patienten mit Typ-2-DM zeigten [15, 17, 18, 23, 24]. Im klinischen Umfeld kann sich mit fortschreitender Hyperglykämie eine Makro- und Mikrovaskulopathie entwickeln [25]. EPCs wurden gut mit der Gefäßfunktion und der Geweberegeneration in Verbindung gebracht. Bei Gewebeischämie können EPCs aus dem Knochenmark zur Gefäßreparatur und Neovaskulogenese mobilisiert werden [26]. Bei Typ-2-DM-Patienten sind Anzahl und Funktion der EPCs durch das Vorliegen vaskulärer Komplikationen beeinträchtigt [27]. Andererseits wird die Neovaskularisation durch VEGF vorangetrieben, das für die Endothelproliferation, Netzwerkbildung und Migration notwendig ist. SDF-1 rekrutiert EPCs aus dem Knochenmark und bindet an CXCR4, um die Angiogenese zu fördern [28]. Allerdings sind die VEGF- und SDF-1-Expressionen in ischämischen Muskeln und EPCs von DM-Patienten verringert [20]. In dieser Studie haben wir außerdem gezeigt, dass die Behandlung mit dem neutralisierenden CXCL5-Antikörper die Zellfunktion in EPCs von Typ-2-DM-Patienten und in HG-stimulierten EPCs von Nicht-DM-Patienten sowie in HAECs mit hochregulierter VEGF- und SDF-1-Expression in vitro verbesserte. Unterdessen reparierte die CXCL5-Hemmung die Angiogenese des Ischämiegewebes mit hochreguliertem VEGF und SDF-1 in beiden Mausmodellen von Typ-1- und Typ-2-DM in vivo.

Während Diabetiker eine pAVK entwickeln können, könnte die Wundheilung bei Diabetikern mit pAVK noch weiter beeinträchtigt sein. Da die Angiogenese für die Wundheilung und die Gewebeintegrität von wesentlicher Bedeutung ist, ist die Verbesserung der Wundheilung einer der In-vivo-Indikatoren für Neovaskularisation. Frühere In-vivo-Studien zeigten, dass diabetische Mäuse schlecht geheilte Wunden mit erhöhter CXCL5-Expression aufwiesen [29]. Andererseits wurde beobachtet, dass ein verringerter CXCL5-Exsudatspiegel unabhängig mit der verzögerten Wundheilung bei Patienten mit diabetischem Fuß verbunden sein könnte [30]. Es war jedoch nicht bekannt, ob eine Reduzierung des CXCL5-Serums die Entstehung von diabetischem Fußgeschwür fördern und die Wundheilung verzögern könnte. Während die mechanistische Rolle von CXCL5 bei der Heilung von diabetischen Fußgeschwüren umstritten zu sein scheint, waren weitere systemische Untersuchungen erforderlich [30]. In unserer Studie verbesserte die direkte systemische Hemmung von CXCL5 die Wundheilung mit einer größeren Wundverschlussfläche sowie einer Kollagenansammlung im Wundbereich bei verschiedenen diabetischen Mausmodellen. Die oben genannten Ergebnisse wurden auch bei CXCL5-Knockout-Diabetikermäusen bestätigt. Dementsprechend deuteten unsere In-vivo-Ergebnisse im Einklang mit unseren In-vitro-Ergebnissen zu EPCs von Typ-2-Diabetikern darauf hin, dass CXCL5 nicht nur ein Indikator war, der die Angiogenese sowie die Wundheilung bei diabetischen Tieren eher beeinträchtigen als fördern könnte. Angesichts der potenziellen Rolle von CXCL5 bei der diabetischen Vaskulopathie ist eine zukünftige klinische Studie angezeigt, um zu klären, ob eine direkte Hemmung auf systemischer CXCL5-Ebene die Entwicklung eines diabetischen Fußgeschwürs verhindern und die Wundheilung bei Typ-1- und Typ-2-Diabetikern verbessern kann.

Es gibt einige kritische Fragen, die möglicherweise noch weiter geklärt werden. Erstens könnten entzündungsfördernde Zytokine und Chemokine an der pathologischen Rolle bei Diabetes beteiligt sein. Eine Entzündung kann zu einer beeinträchtigten Neovaskularisation führen und dysfunktionale EPCs und Endothelzellen verursachen. Wir haben zuvor gezeigt, dass ein entzündungsförderndes Chemokin-Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1β mit diabetischer Neovaskularisation assoziiert ist. MIP-1β reduzierte die CXCR4-Expression und verursachte dysfunktionale EPCs, die die Angiogenese beeinträchtigten [20]. Andererseits wurde gezeigt, dass CXCL5 p65 und den Interleukin (IL)-1β-Promotor in Endothelzellen aus Rattenherzen aktiviert. Darüber hinaus verstärkten durch CXCL5 aktivierte Neutrophile die Entzündungsreaktion, was die Apoptose der Endothelzellen förderte [31]. Basierend auf unseren Ergebnissen wurde erstmals gezeigt, dass die direkte CXCL5-Hemmung die Endothelzellfunktion verbesserte und die proangiogene Proteinexpression in vivo und in vitro erhöhte. Während sowohl MIP-1β als auch CXCL5 und wahrscheinlich auch andere Chemokine die Angiogenese bei Diabetes beeinträchtigen können, können die spezifischen entzündungshemmenden Wirkungen in vivo durch CXCL5-Unterdrückung in Zukunft weiter aufgeklärt werden. Zweitens deutete eine frühere Studie darauf hin, dass die Hemmung von CXCL5 durch neutralisierende Antikörper die Insulinsensitivität und die Glukoseclearance bei insulinresistenten, adipösen Mäusen verbessern könnte [18, 19]. In der aktuellen Studie wurden die Nüchternglukosespiegel durch direkte Hemmung oder Mangel an CXCL5 in verschiedenen diabetischen Tiermodellen nicht signifikant verändert. Die Auswirkungen der CXCL5-Hemmung auf den Nüchternblutzucker waren in der aktuellen und früheren Studie unterschiedlich, was möglicherweise mit unterschiedlichen Dosierungen und Dauer der Antikörperbehandlung sowie dem unterschiedlichen Alter und den unterschiedlichen Modellen der Versuchstiere (db/db Typ 2) zusammenhängt diabetische Mäuse und STZ-induzierte Typ-1-diabetische Mäuse). In der aktuellen In-vivo-Studie wurden das Pankreas-Inselgewebe, der Insulinspiegel und der Glukosetoleranztest nicht überprüft. Es ist nicht bekannt, wenn auch weniger wahrscheinlich, ob die Änderung des Insulinspiegels und der Insulinresistenz Auswirkungen auf die Auswirkungen der CXCL5-Hemmung auf die Angiogenese in den verschiedenen Tiermodellen haben könnte. Die Ergebnisse unserer In-vitro-Studie zeigten jedoch die positiven Auswirkungen der direkten CXCL5-Hemmung auf EPCs von Typ-2-Diabetikern und auf mit HG behandelte EPCs von Nicht-DM-Patienten. Angesichts der wichtigen Rolle von EPCs und Endothelzellen bei der Angiogenese stützen unsere Ergebnisse den direkten Beitrag der CXCL5-Hemmung zur Verbesserung der Angiogenese und Wundheilung bei In-vivo-DM, und diese positiven Wirkungen könnten auf seine angiogenen und entzündungshemmenden Fähigkeiten zurückzuführen sein. Drittens zeigte unsere frühere Studie, dass die MIP-1β-Hemmung die zirkulierenden EPCs steigerte, indem sie ihre Fähigkeit zur Homing vom Knochenmark in die ischämischen Bereiche förderte [20]. Hier beobachteten wir, dass die CXCL5-Hemmung die Anzahl zirkulierender EPC erhöhte, was möglicherweise auf die verbesserte Homing-Fähigkeit zurückzuführen ist. Andere Möglichkeiten wie eine erhöhte Differenzierung und Proliferation oder ein verbessertes Überleben sollten jedoch weiter untersucht werden.

Zusammenfassung der vorteilhaften Wirkungen der CXCL5-Unterdrückung bei diabetischer Vaskulopathie. CXCL5 Chemokine CXC Motiv Ligand 5, CXCR2 Chemokine CXC Motiv Rezeptor 2, EPC endotheliale Vorläuferzelle, ERK extrazelluläre signalregulierte Kinase, DM Diabetes mellitus, IL Interleukin, SDF-1 Stroma Cell-derived Factor 1, TNF-α Tumornekrosefaktor- α, VEGF vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Plasma-CXCL5 bei Typ-2-Diabetikern erhöht war. Die direkte CXCL5-Unterdrückung verbesserte sowohl die EPC- als auch die HAEC-Funktion bei DM. CXCL5 könnte IL-1β/IL-6/TNF-α hochregulieren und VEGF/SDF-1 über ERK/p65-Aktivierung durch CXCR2 herunterregulieren. Darüber hinaus erhöhte die Unterdrückung von CXCL5 die Anzahl der EPCs im Kreislauf, verbesserte die Wiederherstellung des ischämischen Blutflusses in den Beinen, erhöhte den Matrigel-Hämoglobingehalt und die Anzahl der Gefäße, erhöhte die Neovaskularisation des Aortenrings und erhöhte den Wundverschluss in verschiedenen diabetischen Tiermodellen. Ähnliche Ergebnisse konnten auch bei CXCL5-Knockout-Diabetikermäusen beobachtet werden. Zusammengenommen könnte CXCL5 sowohl bei klinischer als auch experimenteller DM zur Gefäßbeeinträchtigung beitragen. Es könnte gerechtfertigt sein, eine neuartige Therapiestrategie, die auf CXCL5 abzielt, als potenzielle Behandlung für diabetische Gefäßkomplikationen in der Zukunft zu validieren.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1186/s12933-023-01929-x

Chemokin-CXC-Motivligand 5

CXCL5 Knockout

Chemokin-CXC-Motivrezeptor 2

Diabetes Mellitus

Endotheliale Vorläuferzellen

Extrazelluläre signalregulierte Kinase

Endothelzellen der menschlichen Aorta

Hoher Glukosespiegel

Interleukin

Periphere Arterienerkrankung

Von Stromazellen abgeleiteter Faktor 1

Streptozotocin

Tumornekrosefaktor

Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

Wildtyp

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Diese Arbeit wird insbesondere durch den „Yin Yen-Liang Foundation Development and Construction Plan“ des College of Medicine der National Yang Ming Chiao Tung University unterstützt.

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Forschungsstipendien MOST 110-2314-B-A49A-552-MY3 (an TT Chang) und MOST 107-2314-B-010-060-MY3 (an JW Chen) vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie unterstützt. Taipei, Taiwan, ROC und V110C-065 vom Taipei Veterans General Hospital (an JW Chen), Taipei, Taiwan, ROC.

Abteilung und Institut für Pharmakologie, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, Taipeh, Taiwan

Ching Chen, Jaw-Wen Chen & Ting-Ting Chang

Medizinische Fakultät, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, Taipeh, Taiwan

Ching Chen, Liang-Yu Lin, Jaw-Wen Chen und Ting-Ting Chang

Abteilung für Endokrinologie und Stoffwechsel, Abteilung für Medizin, Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan

Liang-Yu Lin

Gesundheits- und Dienstleistungszentrum, Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan

Jaw-Wen Chen

Abteilung für Kardiologie, Abteilung für Medizin, Taipei Medical University Hospital, Taipei, Taiwan

Jaw-Wen Chen

Herz-Kreislauf-Forschungszentrum, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, Taipeh, Taiwan

Jaw-Wen Chen

Herz-Kreislauf-Forschungszentrum, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan

Jaw-Wen Chen

Biomedizinische Industrie Ph.D. Programm, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, Taipei, Taiwan

Ting-Ting Chang

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CC: Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf. L-YL: formale Analyse, Ressource. J-WC: Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Finanzierungsbeschaffung. T-TC: Konzeptualisierung, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Betreuung, Finanzierungsbeschaffung. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Ting-Ting Chang.

Die Humanstudie wurde vom Institutional Review Board des Taipei Veterans General Hospital genehmigt (IRB-2018-01-001AC). Die Einverständniserklärung aller in die Studie einbezogenen Einzelteilnehmer wurde eingeholt. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Yang Ming Chiao Tung University (IACUC Nr. 1091104) genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Die ursprüngliche Online-Version dieses Artikels wurde überarbeitet: Die Fehler in Abbildung 6H wurden korrigiert.

Klinische Merkmale der Studienpopulation. Abbildung S1. Morphologie und Charakterisierung menschlicher EPCs aus peripherem Blut. Abbildung S2. CXCL5 übte über die ERK/p65-Aktivierung durch CXCR2 proinflammatorische und antiangiogene Wirkungen aus. Abbildung S3. Die Auswirkungen des neutralisierenden CXCL5-Antikörpers auf das Körpergewicht, den Blutzucker und die H&E-Färbung von Schnitten aus Matrigelpfropfen und Wundbereichen bei Typ-1-DM-Mäusen. Abbildung S4. Die Auswirkungen des neutralisierenden CXCL5-Antikörpers auf das Körpergewicht, den Blutzucker und die H&E-Färbung von Schnitten aus Matrigelpfropfen und Wundbereichen bei Typ-2-DM-Mäusen. Abbildung S5. Das Körpergewicht, der Blutzucker und die H&E-Färbung von Schnitten aus Matrigelpfropfen und Wundbereichen bei STZ-induzierten CXCL5KO-diabetischen Mäusen. Abbildung S6. Komplette Western-Blot-Gele in dieser Studie.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, C., Lin, LY., Chen, JW. et al. Die CXCL5-Unterdrückung stellt die Neovaskularisation wieder her und beschleunigt die Wundheilung bei Diabetes mellitus. Cardiovasc Diabetol 22, 172 (2023). https://doi.org/10.1186/s12933-023-01900-w

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Eingegangen: 13. Mai 2023

Angenommen: 22. Juni 2023

Veröffentlicht: 07. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12933-023-01900-w

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